小菜蛾類鈣粘蛋白片段的原核融合表達載體構建及其條件優化

鄭曉旭 楊峰山 朱 勛 張友軍*

（1黑龍江大學生命科學學院，微生物黑龍江省高校重點實驗室，黑龍江哈爾濱150080 ；2 中國農業科學院蔬菜花卉研究所，北京1 00081）

小菜蛾（Plutella xylostella）屬鱗翅目菜蛾科，是重要的植食性害蟲。該蟲對多種作物尤其是十字花科蔬菜構成嚴重威脅，嚴重為害時能造成作物90%以上的損失，據全球統計每年用于防治小菜蛾的費用達40億～50億美元（Talekar＆Shelton，1993；Furlong et al.，2012）。蘇云金芽孢桿菌（Bacillus thuringiensis，Bt）可產生多種具有殺蟲活性的晶體蛋白（Insecticidal crystal proteins，ICPs），對鱗翅目、雙翅目、鞘翅目等害蟲具有較好的殺蟲活性，這些蛋白作為新興的農業害蟲殺蟲劑被廣泛地噴灑或通過轉基因技術轉入作物中作為抗蟲作物在世界各地廣泛種植，導致許多地區田間小菜蛾種群產生抗藥性（Schnepf et al.，1998；Fernández et al.，2008；Tabashnik et al.，2011；Vachon et al.，2012）。已經逐漸發現有多種害蟲（草地貪夜蛾Spodoptera frugiperda、玉米莖夜蛾Busseola fusca、谷實夜蛾Helicoverpa zea）對Bt作物產生抗性（Tabashnik et al.，2009），因此如何解決害蟲的抗性問題迫在眉睫。

鈣粘蛋白是鈣離子依賴的跨膜糖蛋白家族的重要成員，普遍存在于脊椎無脊椎動物體內，在多細胞有機體中起著保持細胞完整性的作用，在細胞間起連接作用。昆蟲類鈣粘蛋白（Cadherin-like protein）結構與鈣粘蛋白（cadherin）很相似，從N端至C端依次是信號肽、由9～12個重復子（cadherin repeats，CR）組成的重復區、近膜區（membrane proximal extracellular domain，MPED）、跨膜區（ transmembrane domain ）和胞質區（intracell ular domain）（Xie et al.，2005；Hua et al.，2008）5個功能區域。Vadlamudi等（1993）在煙草天蛾Manduca sexta的刷狀緣膜囊（BBMV）上首先發現類鈣粘蛋白是Bt CrylA類蛋白（Bt菌產生的殺蟲晶體蛋白）的一種受體蛋白。根據孔隙形成假說，Bt Cry1A毒素首先形成130 kDa大小的前毒素，被昆蟲吞食進入中腸內，在中腸液的堿性條件下發生溶解作用，形成60 kDa的活性毒素單體，毒素單體與位于昆蟲中腸上皮細胞的類鈣粘蛋白表現出高的親活性進而水解掉活性毒素的α-1螺旋和N-末端形成促進孔隙形成的寡聚物，進一步與氨肽酶、堿性磷酸酶等二級受體結合導致中腸孔隙形成，細胞裂解，最終導致昆蟲死亡（Pardo-López et al.，2006；Soberón et al.，2007；Heckel，2012）。昆蟲類鈣粘蛋白靠近近膜區相鄰的重復區域是與Bt Cry1A類殺蟲蛋白結合并最終形成孔洞的關鍵區域，有時具有多個結合位點。Gómez等（2002）率先利用噬菌體顯示技術篩選得到了煙草天蛾類鈣粘蛋白（Bt-R1）及家蠶類鈣粘蛋白（Bt-R175）與Cry1A類殺蟲蛋白相結合的區域，兩者的氨基酸序列分別為869HITDTNNK876及1296LDETTN1301。進一步研究表明煙草天蛾類鈣粘蛋白Bt-R1a至少有3個與Cry1A類殺蟲蛋白相互作用的部位（Gómez et al.，2002，2003，2006），其中CR12是與殺蟲蛋白相結合的關鍵區域，而家蠶類鈣粘蛋白Bt-R175受體與殺蟲蛋白結合的關鍵區域則是CR9（Hua et al.，2004）。Chen等（2007）報道了煙草天蛾類鈣粘蛋白Bt-R1中含CR12-MPED區的多肽，可在大腸桿菌中表達并作為CrylA殺蟲蛋白的增效劑，用于防治鱗翅目幼蟲。隨后也有報道煙草天蛾類鈣粘蛋白的CR7、CR11也是Cry1A的結合位點，CR7與 CR11片段也能提高Cry1Ac與Cry1Ab殺蟲蛋白對煙草天蛾 幼蟲的毒性，但是其增效作用弱于CR12片段。除此之外，CR12片段不僅可以增強Cry1Ab殺蟲蛋白對煙草天蛾幼蟲的毒殺活性，還對其他鱗翅目幼蟲也有增效作用（Pacheco et al.，2 009）。隨后岡比亞按蚊Anopheles gambiae（Hua et al.，2008）、玉米根葉甲Diabrotica virgifera（Park et al.，2009）、棉鈴蟲（Peng et al.，2010）、甜菜夜蛾（Lu et al.，2012）等也相繼被報道包含殺蟲蛋白結合區域的類鈣粘蛋白片段，能增強Cry1類殺蟲蛋白對其幼蟲的殺蟲活性。這些研究結果充分說明類鈣粘蛋白片段在害蟲防治上具有潛在的應用價值。

小菜蛾是一種世界性的農業害蟲，在田間產生抗性多年并且極難治理。如何能夠利用類鈣粘蛋白片段防治小菜蛾是一種新的思路和途徑。因此能夠誘導得到大量高效的小菜蛾類鈣粘蛋白連接區域片段蛋白是最首要的任務。本試驗通過對小菜蛾鈣粘蛋白序列的分析，得到了小菜蛾類鈣粘蛋白靠近近膜區相鄰的重復區序列片段PxCad，構建了大腸桿菌原核表達載體，經過溫度、時間、IPTG濃度，以及可溶性分析方面的條件誘導優化，最終獲得了大量的類鈣粘蛋白片段融合蛋白，為進一步的增效研究奠定了基礎。

1 材料與方法

1.1 供試材料

小菜蛾敏感種群（DBM1Ac-S）：2003年由美國康奈爾大學趙建周教授提供。在中國農業科學院蔬菜花卉研究所養蟲室內用無蟲甘藍苗進行繼代飼養，期間未接觸任何殺蟲劑。

表達載體pET28a 由蔬菜有害生物控制與優質栽培北京市重點實驗室保存，克隆載體pEASY-T5 Zero Cloning Kit和大腸桿菌E.coliBL21（DE3）購自全式金公司，Total RNA提取試劑、mRNA純化試劑盒、1st St rand cDNA、Synthesis Kit、DNA Marker、質粒 DNA 提取純化試劑盒、DNA回收試劑盒購自TIANGEN公司，TaqDNA 聚合酶購自TaKaRa公司，限制性內切酶BamHI、EcoRI，及T4 DNA 連接酶均購自NEB公司，蛋白質分子量標準購自Thermo公司，引物由北京擎科新業生物技術有限公司提供。

引物設計：根據 GenBank公布的序列（Accession No.EF541176.1） 及蛋白結構分析，選取靠近近膜區相鄰的重復序列設計引物，下劃線部分為引入的酶切位點。E-P.xy-cad-F：CGGGATCCCTCACGGAGGCTTTCCA（BamHI酶切位點）；E-P.xy-cad-R：CGGAATTCAGAGGTGTCCGCTAC CAT（EcoRI酶切位點）。

1.2 試驗方法

1.2.1PxCad基因的擴增和克 隆載體的構建 取4齡小菜蛾中腸，利用Trizol試劑提取總RNA；通過逆轉錄試劑盒將總RNA反轉錄成cDNA，再以cDNA為模板，通過PCR擴增出目的基因。PCR 的反應條件為：94 ℃ 3 min；94 ℃ 45 s，56 ℃ 45 s，72 ℃ 1 min，32 個循環；72 ℃ 10 min。利用克隆載體pEASY-T5 Zero Cloning Kit試劑盒構建PxCad-T5克隆載體。

1.2.2 原核表達載體的構建 用BamHI和EcoRI雙酶切上述的PxCad-T5克隆載體和 pET28a原核表達載體，再分別切膠回收純化。載體和融合片段（PxCad片段）按1∶3比例混合后加入T4 DNA連接酶，16 ℃過夜連接后轉化大腸桿菌E.coliBL21（DE3），挑取陽性克隆抽提質粒。并將雙酶切及測序鑒定正確的重組質粒，命名為PxCad-pET28a。

1.2.3 PxCad-pET28a/E.coliBL21（DE3）菌生長曲線測定 將種子液（構建好的菌株接種到2 mL的LB培養液中過夜培養好的菌液）按1%的比例接種于200 mL LB（Kna+），37 ℃，180 r·min-1，振搖培養，并開始計時。每小時從三角瓶內取2 mL 菌懸液，測定其吸光度OD600值，共測定10 h。以培養時間為橫坐標，吸光度OD600值為縱坐標，作生長曲線圖。

1.2.4 融合蛋白的誘導表達 挑取陽性單菌落接種到含卡那霉素的LB液體培養基中，于37 ℃，180 r·min-1，振搖培養過夜。次日，按照1%的比例接入同樣的培養基中，振蕩培養至OD600值約為0.6時，分別對融合蛋白表達的最適IPTG濃度、最佳時間和最佳溫度進行條件誘導，并進行不同溫度下融合蛋白可溶性分析。

融合蛋白表達最適IPTG濃度的誘導：在提前準備好的OD600值為0.6的菌液中分別加入0.05、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8 mmol·L-1和 1.0 mmol·L-1IPTG 在 30℃、180 r·min-1條件下培養 24 h，以空載體作為對照，誘導24 h后提取蛋白經SDS-PAGE電泳選取最佳的IPTG誘導濃度。

融合蛋白表達最 佳時間的誘導：利用篩選的蛋白表達最適IPTG濃度，在30 ℃，180 r·min-1條件下培養，分別在2、4、8、12、24、36、48 h取樣，提取蛋白經SDS-PAGE 電泳選取最佳的誘導時間。

融合蛋白表達最佳溫度的誘導：利用篩選的最適IPTG濃度和最佳誘導時間，分別在16、25、30、37 ℃不同溫度下180 r·min-1振搖培養，提取融合蛋白經SDS-PAGE 電泳選取最佳的誘導溫度。

不同溫度下融合蛋白的可溶性分析：將上述4個不同溫度誘導的菌液離心收集菌體，超聲破碎后分為全菌、上清、沉淀進行SDS-PAGE電泳，檢測不同溫度下融合蛋白的表達及可溶性情況。

2 結果與分析

2.1 小菜蛾鈣粘蛋白基因重組載體的構建

提取小菜蛾4齡幼蟲中腸RNA，并反轉錄為cDNA，作為實驗用模板。根據篩選得到的靠近近膜區相鄰的重復序列的特異性引物，擴展得到小菜蛾鈣粘蛋白基因目的片段。從凝膠電泳（圖1）可見，用特異性引物PCR擴增出432 bp大小的目的條帶、pET28a單酶切5 369 bp大小的片段、重組質粒單酶切5 801 bp大小的片段、重組質粒經BamHI、EcoRI雙酶切切出pET28a和目的片段兩個大小相符的片段，可以看出抽提的質粒包含有正確的酶切位點及預期插入片段，菌液測序結果表明插入序列完全與預期符合，重組質粒構建成功。

2.2 生長曲線

生長曲線測定結果表明，PxCad-pET28a/E.coliBL21（DE3）工程菌在接種1.5 h后進入對數生長期（圖2），約2.5 h左右，OD600達0.6，即為對數生長期中期，菌株生長速度快，呈指數級生長，新陳代謝活躍，蛋白表達水平高，所以可選取此時加入IPTG誘導表達融合蛋白。

2.3 重組蛋白的誘導表達

在30 ℃，180 r·min-1條件下對重組菌進行IPTG不同濃度誘導表達24 h，同時以空載體作為對照。提取蛋白經SDS-PAGE電泳（圖3）可以看出，重組菌體與空載體對照菌和未誘導菌相比，重組菌出現預期靶標大小相符的目的蛋白條帶（16 kDa），并且在IPTG濃度為0.1 mmol·L-1時蛋白的表達量最高，然后隨著IPTG濃度的增高表達量逐漸降低，并且在1.0 mmol·L-1時表達量達到最低，所以最佳IPTG誘導終濃度為0.1 mmol·L-1。

選取最適IPTG濃度0.1 mmol·L-1對重組菌在30 ℃、180 r·min-1條件下進行不同時間的誘導表達，提取蛋白經SDS-PAGE電泳（圖4）可以看出，重組菌體與空載體對照菌和未誘導菌相比，重組菌出現大小相符的目的蛋白條帶（16 kDa），隨著誘導時間的增加，目的蛋白的表達量逐漸增多，并且在36 h時表達量達到最高，在48 h時表達量又略有下降，因此36 h為最佳誘導時間。

圖1 小菜蛾PxCad基因重組載體的構建

圖2 融合蛋白PxCad-pET28a/E.coli BL21（DE3）工程菌株的生長曲線

圖3 不同IPTG 濃度對PxCad-pET28a/E.coli BL21（DE3） 表達量的影響

分別選取最適的IPTG濃度（0.1 mmol·L-1）和最佳誘導時間（36 h），在16、25、30、37℃等不同溫度下180 r·min-1振搖培養。提取蛋白經SDS-PAGE電泳（圖5）可以看出，目的蛋白（16 kDa）在16 ℃表達量很低，在25～37 ℃表達量依次減少，在25 ℃表達量最高，因此25 ℃為最高表達量的誘導溫度。

圖4 不同誘導時間對PxCad-pET28a/E.coli BL21（DE3）表達量的影響

圖5 不同誘導溫度對PxCad-pET28a/E.coli BL21（DE3）表達量的影響

收集以上不同溫度菌體經超聲波破碎對不同溫度表達的蛋白進行可溶性分析，從SDSPAGE電泳結果（圖6）可以看出，16、25、30、37 ℃下表達的蛋白均以包涵體的形式存在，由此可見溫度對蛋白的可溶性并沒有太大的影響。

圖6 PxCad-pET28a/ E.coli BL21（DE3）不同溫度表達產物可溶性分析

3 結論與討論

小菜蛾類鈣粘蛋白基因全長5 380 bp，本試驗克隆小菜蛾類鈣粘蛋白靠近近膜區相鄰的重復區序列片段基因全長432 bp，獲得與理論值相符的16 kDa的融合蛋白。最佳誘導溫度25 ℃，最佳IPTG誘導終濃度0.1 mmol·L-1，最佳誘導時間為36 h，蛋白在16、25、30、37 ℃條件下以包涵體的形式存在。

由于昆蟲中不同種類之間類鈣粘蛋白具有高度同源性（Bel ＆ Escribe，2006）的特點，小菜蛾與其他鱗翅目昆蟲的類鈣粘蛋白一樣，包含5個基本結構，具有昆蟲鈣粘蛋白典型的結構特征。這種蛋白結構上的保守性說明鱗翅目昆蟲與Bt相關的類鈣粘蛋白很可能也享有進化上的保守功能。已有的結果表明，昆蟲類鈣粘蛋白的鈣粘蛋白重復區域為該蛋白與殺蟲蛋白結合的功能區域，但不同的昆蟲結合區域有所差異，多數為靠近近膜區的重復區域。如棉鈴蟲、棉紅鈴蟲靠近近膜區的鈣粘蛋白重復區域CR10-11是Cry1Ac殺蟲蛋白的結合區域，而家蠶Bt-R175受體與殺蟲蛋白結合的關鍵區域則是CR9（Hua et al.，2004；Fabrick ＆Tabashnik，2007）。煙草天蛾 Bt-R1a 受體中CR7、CR11與CR12均為殺蟲蛋白的結合區域，但CR12才是與殺蟲蛋白相結合的關鍵區域（Coates et al.，2005）。由于鱗翅目昆蟲類鈣粘蛋白的高度保守性，小菜蛾類鈣粘蛋白與Cry類殺蟲蛋白的結合區域很可能也在靠近近膜區的鈣粘蛋白重復區域，這種功能上的保守性有利于闡明Bt Cry類殺蟲蛋白對小菜蛾的分子機理以及鱗翅目小菜蛾對Bt Cry類殺蟲蛋白產生抗性的機理。

有文獻報道棉鈴蟲HaCad片段包含殺蟲蛋白結合區域，所表達的包涵體蛋白能增強Cry1Ac殺蟲蛋白對棉鈴蟲幼蟲的殺蟲活性（Peng et al.，2009）。然而，也有報道稱可溶性的棉鈴蟲CR10-11片段降低了Cry1Ac的毒性（Liu et al.，2009）。包涵體類鈣粘蛋白片段與可溶性片段對Cry類殺蟲蛋白的作用不同，前者對殺蟲蛋白有增效作用，而后者則表現為減效。這說明昆蟲類鈣粘蛋白對Bt殺蟲蛋白的增效作用，和昆蟲與殺蟲蛋白種類、類鈣粘蛋白與殺蟲蛋白的質量比以及表達多肽片段的形式密切相關。因此，表達時控制融合蛋白包涵體的含量尤其重要。

原核表達中外源蛋白表達量的多少受到多種因素的影響，其中與溫度、誘導劑誘導時間和誘導濃度的關系密切相關。溫度過高或過低表達量都有所降低，Fass等（1991）研究表明IPTG的劑量有一定范圍，濃度過低影響目的蛋白的表達，濃度過高則抑制細菌的生長；誘導時間也會對蛋白表達量有一定影響，誘導時間太短，菌體量少，目的蛋白量也少，誘導時間太長，菌體老化，酶體系統活性減弱，代謝速度減慢，轉錄翻譯遲鈍，不利于目的蛋白的表達。不同的基因由于其固有的特殊性，最優的表達條件也不盡相同，本試驗經過條件的誘導優化，獲取了大量的包涵體融合蛋白，對于明確其與Bt蛋白的相互作用機制，以及生產上利用類鈣粘蛋白對Bt的增效作用的應用研究奠定了可行性的基礎。

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