力竭運動后大鼠海馬bFGF及其受體FGFR1表達的變化

馬春偉，袁瓊嘉

(1.運城學院體育系，山西運城044000;2.成都體育學院運動醫學系，四川成都610041)

國際上把21世紀開始的時代稱為“腦科學時代”。在體育研究領域，國內外眾多學者對運動與中樞神經系統之間的關系進行著積極的探索。堿性成纖維生長因子(Basic fibroblast growth factor，bFGF)是一種廣譜的神經營養因子和促分裂因子。李立新［1］發現正常情況下，腦內只有輕微的bFGF免疫反應，對維持中樞神經系統的正常功能并延緩細胞老化、中樞神經系統神經細胞的發育、成熟和存活有著極為重要的影響。堿性成纖維生長因子受體(fibroblast growth factor receptor1，FGFR1)是 bFGF的高親和力受體，廣泛地分布于靶細胞表面。bFGF可通過激活FGFR1起作用［2］，所以，bFGF及其受體 FGFR1可保護神經元免受缺血缺氧所致的毒害，并保護受損的神經元。bFGF及其受體FGFR1分布于鼠腦多個腦區，較高表達部位為海馬。海馬區作為邊緣系統的重要組成部分，是介導應激反應的高級中樞的重要腦區之一，在下丘腦調節內分泌的變化過程中，對下丘腦有著非常重要的影響，而運動是一種典型的應激。因此，對海馬區的研究越來越受到運動醫學界的重視。

目前，國內外關于一次性力竭運動對大腦海馬bFGF及其受體FGFR1表達的研究鮮有報道。本文應用光鏡觀察、電鏡觀察及免疫組織化學方法研究大鼠一次性力竭游泳運動后海馬bFGF及其受體FGFR1表達的動態變化規律，及其與海馬組織中神經的再生和保護神經元對抗缺血缺氧的損傷之間的關系，為運動性中樞疲勞的消除機制提供一定的神經生物學依據。

1 研究對象與方法

1.1 研究對象

選用成年三月齡、健康雄性SPF級(無特定病原體動物)的SD大鼠50只，體重200±20g，由四川大學華西醫學中心實驗動物中心提供。國家標準嚙齒類動物飼養籠分籠喂養，自由攝食飲水，保證通風條件良好，室溫保持在25±2℃，相對濕度40% ～60%，自然光照。

1.2 研究方法

1.2.1 動物分組及動物造模

大鼠購進后隨機分為5組:空白對照組(C組，n=10)、力竭運動組(E組，n=40)，根據取材時間不同將E組隨機分為力竭運動即刻組(E1組)、力竭運動12 h組(E2組)、力竭運動24 h組(E3組)、力竭運動48小時組(E4組)。C組大鼠分籠常規喂養，不加任何運動干預。E組大鼠在游泳槽內進行適應性游泳3天(水深60 cm，水溫33士2℃)，每天游泳10 min;正式試驗時，E組大鼠按每100 g體重負重5 g(5%)游泳至力竭。記錄入水和出水時間，四組中均未出現溺水死亡的現象。

1.2.2 灌注取材

各組均隨機取8只灌注取材。C組經腹腔注射2%戊巴比妥鈉(2.3 ml/kg)麻醉，將其仰臥，固定四肢及頭部于解剖臺，然后打開大鼠的胸腔，快速地將針頭刺入左心室并插進主動脈，用止血鉗固定;然后打開生理鹽水的開關，用止血鉗夾住下行動脈，剪開右心耳讓血液流出，直到發現流出液變清，則關閉生理鹽水開關，打開多聚甲醛灌注液的開關，解開頭部及四肢，可見到上肢及頭部肌肉痙攣漸硬、變白;待見到灌注液從鼻中滴流出，則關閉多聚甲醛開關，用斷頭鍘將頭取下，用解剖剪自枕骨大孔兩側沿耳朵稍后上方各剪一刀(注意不要破壞腦組織)，翻起顱骨，將大腦輕輕取下，置于托盤中在視交叉后1 mm及4 mm處冠狀切面切開，取中間塊放入裝有4%甲醛固定液的小瓶中浸泡固定，室溫貯存。E1組、E2組、E3組、E4組分別在力竭游泳后即刻、12 h、24 h、48 h按以上方法進行取材。然后進行石蠟包埋、HE染色、免疫組化。

1.2.3 免疫組化結果分析

將免疫組織化學切片在計算機圖像采集分析系統(Nikon＆SPOT美國生產，軟件為Version3.0)上進行采圖(采圖位置嚴格限定在海馬區，每一例的采圖數不少于5幅，且所采之圖應圍繞一個中心位點作連續采圖)。圖像的分析用Image Pro-Plus(IPP)定量分析bFGF和FGFR1的表達程度，測定積分光密度值(Integreted Optical Density，IOD)，然后把所得數據轉換到Microsoft EXCEL進行統計。

所有實驗數據均用SPSS 17.0進行統計學處理，實驗結果所得數據均以“均數±標準誤”表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD法。顯著性水平以P＜0.05為具有顯著性意義，P＜0.01為具有非常顯著性意義。然后根據統計結果進行分析，得出本次實驗的結論。

2 實驗結果

在光鏡下觀察bFGF及FGFR1陽性染色主要分布于胞漿和核膜中，為棕黃色的細小顆粒，bFGF及FGFR1陰性對照組未見細胞著色。

2.1 大鼠運動后不同時段的bFGF免疫組化染色結果

C組海馬區未檢測到明顯的陽性表達(見圖1)。

E1組海馬bFGF陽性表達強度，較C組有非常顯著升高(P ＜0.01)(見圖2)。

E2組海馬bFGF陽性表達較C組有顯著性升高(P＜0.05)，較E1組有非常顯著下降(P ＜0.01)(見圖3)。

E3組海馬bFGF陽性表達較C組有非常顯著性升高(P＜0.01)，較E1有非常顯著性下降(P＜0.01)，較E2組有非常顯著性上升(P ＜0.01)(見圖4)。

E4組海馬bFGF陽性表達較C組有所升高，但不具有統計學意義 (P＞0.05)，較E1組有非常顯著性下降(P＜0.01)，較E2組有非常顯著性下降(P＜0.01)，較 E3組有非常顯著性下降(P ＜0.01)(見圖5、圖6)。

一次性游泳力竭運動后的不同時段，大鼠海馬bFGF免疫組化染色切片采用計算機圖像自動分析系統分析、SPSS 17.0統計學處理，結果如表1:

表1 大鼠運動后不同時段海馬神經元bFGF表達強度變化(積分光密度IOD)

2.2 大鼠運動后不同時段的FGFR1免疫組化染色結果

C組海馬區未檢測到明顯的陽性表達(見圖7)。

E1組海馬FGFR1陽性表達強度，較C組有非常顯著升高(P ＜0.01)(見圖8)。

E2組海馬FGFR1陽性表達較C組有非常顯著性升高(P＜0.01)，較E1組有非常顯著下降(P＜0.01)(見圖9)。

E3組海馬FGFR1陽性表達較C組有顯著性上升(P＜0.01)，較 E1有非常顯著性下降(P＜0.01)，較E2組有非常顯著性下降(P＜0.01)(見圖10)。

E4組海馬FGFR1陽性表達較C組有非常顯著性下降(P＜0.01)，較 E1有非常顯著性下降(P＜0.01)，較 E2組有非常顯著性下降(P＜0.01)，較E3組有非常顯著性下降(P＜0.01)(見圖11、圖12)。

一次性游泳力竭運動后的不同時段，大鼠海馬FGFR1免疫組化染色切片采用計算機圖像自動分析系統分析、SPSS 17.0統計學處理，結果如表2:

表2 大鼠運動后不同時段海馬神經元FGFR1表達強度變化(積分光密度IOD)

2.3 大鼠運動后不同時段的bFGF及FGFR1的相關關系

由圖可知，在空白組、力竭運動后即刻組、12 h組、48 h組bFGF及FGFR1呈正相關，而24 h組無顯著相關性(見表3、圖13)。

表3 大腦海馬bFGF與FGFR1陽性表達強度的同步變化

bFGF FGFR1運動后48 h組(E4)組別21.14±1.54 15.74±0.15

圖1海馬區未檢測到明顯的bFGF陽性表達。

圖2海馬區的bFGF陽性表達明顯，大部分細胞胞漿呈棕黃色。

圖3海馬區bFGF陽性表達比較明顯，可見小部分細胞胞漿呈棕黃色。

圖4海馬區bFGF陽性表達相對明顯，可見大多數細胞胞漿呈棕黃色。

圖5海馬區bFGF陽性表達不明顯，極少部分細胞胞漿呈棕黃色。

圖6海馬區未檢測到明顯的FGFR1陽性表達。

圖7海馬區的FGFR1陽性表達明顯，大部分細胞胞漿呈棕黃色。

圖8海馬區FGFR1陽性表達比較明顯，可見較大部分細胞胞漿呈棕黃色。

圖9海馬區FGFR1陽性表達相對明顯，可見少數細胞胞漿呈棕黃色。

圖10海馬區FGFR1陽性表達不明顯。

圖1 bFGF在C組中的表達(×400)

圖2 bFGF在E1組中的表達(×400)

圖3 bFGF在E2組中的表達(×400)

圖4 bFGF在E3組中的表達(×400)

圖5 bFGF在E4組中的表達(×400)

圖6 海馬BFCF陽性表達強度(IOD)的動態變化

圖7 FGFR1在C組中的表達(×400)

圖8 FGFR1在E1組中的表達(×400)

圖9 FGFR1在E2組中的表達(×400)

圖10 FGFR1在E3組中的表達(×400)

圖11 FGFR1在E4組中的表達(×400)

圖12 海馬FGFR1陽性表達強度(IOD)的動態變化

圖13 海馬bFGF與FGFR1陽性表達強度的同步變化

3 分析與討論

3.1 一次性力竭運動對bFGF及FGFR1的影響

3.1.1 一次性力竭運動對bFGF的影響

本實驗采用的是一次性游泳力竭運動，分別觀察了力竭運動后即刻、12 h、24 h及48 h四個時相大鼠海馬bFGF表達水平的動態變化。

結果顯示:空白組大鼠海馬偶見散在的極少量bFGF陽性表達，力竭運動后即刻組大鼠海馬bFGF表達水平有明顯升高，甚至達到最高值;運動后12 h組有所下降，但仍然明顯高于空白組;運動后24 h組較運動后12 h組有明顯的升高，但明顯低于運動后即刻組和空白組;運動后48 h組恢復到接近空白組水平。

一次性游泳力竭運動后，大鼠海馬bFGF表達水平隨時間推移而出現的先升高后降低繼而又上升又降下的兩個類似拋物線形的變化，與損傷海馬神經元的保護過程曲線趨于一致，據此我們推測bFGF作為一種神經營養因子，可能參與了一次性極限負荷運動所導致的運動性中樞疲勞的保護過程。國內外有關力竭運動對中樞神經系統內bFGF影響的報道并不多。何葉等［3］對長期力竭性訓練對大鼠海馬神經元凋亡的試驗發現:力竭運動可致腦損傷，由于大腦在力竭運動時處于相對的缺血缺氧狀態，出現神經細胞線粒體鈣超載，并發生缺血缺氧性損傷。

3.1.2 一次性力竭運動對FGFR1的影響

本實驗采用的是一次性游泳力竭運動，分別觀察了力竭運動后即刻、12 h、24 h及48 h四個時相大鼠海馬FGFR1表達水平的動態變化。

結果顯示:空白組大鼠海馬中FGFR1基本呈陰性表達，力竭運動后即刻組大鼠海馬FGFR1表達水平有明顯升高，甚至達到最高值;運動后12 h組有所下降，但仍然明顯高于空白組;運動后24 h組較運動后12 h組有明顯的下降趨勢;運動后48 h組恢復到空白組水平以下。

一次性游泳力竭運動后，大鼠海馬FGFR1表達水平隨時間推移而出現的先升高后降低的類似拋物線形的變化，與損傷海馬神經元的保護過程曲線趨于一致，據此我們推測FGFR1作為bFGF的受體，可能輔助了bFGF參與一次性極限負荷運動所導致的運動性中樞疲勞的保護過程。

3.2 一次性力竭運動影響bFGF及FGFR1的可能機制

3.2.1 一次性力竭運動影響bFGF的可能機制

在本實驗中，在運動后即刻bFGF呈明顯的上升趨勢，這與李立新［1］發現腦損傷后的局部bFGF免疫反應明顯增強的報道相一致。這可能由于一次性力竭運動后即刻引發大鼠腦缺血，腦組織局部神經營養因子合成或轉運障礙，細胞微環境Ca2+平衡紊亂造成胞漿內Ca2+濃度增加，激活內源性核酸酶，導致神經細胞凋亡及產生大量興奮性氨基酸，此時bFGF陽性表達增強，以對抗興奮性氨基酸毒性作用，抑制Ca2+通道上升和增強細胞抗氧化能力。K+-Ca2+通道的激活是神經元自身的一種保護作用，在一次性力竭運動后bFGF與其受體FGFR1特異性結合，激活K+-Ca2+通道，激活酪氨酸激酶，影響谷氨酸受體蛋白、Ca2+結合蛋白等的表達而穩定Ca2+通道，拮抗缺氧、興奮性氨基酸、自由基等的損害，抑制細胞凋亡的發生和發展。本實驗在運動后即刻bFGF表達強度明顯上升，可使K+-Ca2+通道激活，對調節神經元的興奮性可能具有重要作用。因此，bFGF能穩定運動所致的病理狀態細胞微環境中Ca2+平衡，同時及時補充神經組織局部因缺血、創傷造成的神經營養因子合成障礙，從而保護神經元。在保護神經元的過程中，bFGF逐漸被消耗，其表達強度也將逐漸減弱，這與本試驗中在運動后12 h和運動后48 h其表達強度依次下降相吻合。當受損細胞修復完成后，細胞中的bFGF也不再表達［4］，至運動后48 h時降低至類似空白組水平，推測在運動休息過程中，隨著大腦微循環的增加，缺血缺氧的狀態得到改善，體內的代謝逐漸恢復正常，也表明一次性力竭運動造成大鼠海馬神經元的改變是可逆的。而在本實驗中，在運動后24 h時，bFGF有一個明顯的上升過程，這是可能是由于發生了遲發性神經元損傷。有學者指出:腦缺血可造成易損區神經元群變性、死亡，再灌注后數十小時仍可見其病理變化，稱為遲發性神經元損傷(Delayed neuronal damage，DND)［5］。腦缺血后興奮性氨基酸(如L-谷氨酸)過度釋放可能是遲發性神經元損傷的一個重要因素［6］。本實驗可能由于發生了遲發性神經元損傷，再次導致神經細胞凋亡并產生大量興奮性氨基酸，bFGF陽性表達也同時增強，用以對抗興奮性氨基酸毒性作用，抑制Ca2+通道上升和增強細胞抗氧化能力［7］。

3.2.2 一次性力竭運動影響FGFR1的可能機制

堿性成纖維細胞生長因子受體(Fibroblast Growth Factors Receptors1，FGFR1)是一類穿膜的酪氨酸激酶受體，它介導 bFGF信號傳遞入細胞質中［8］。Zoe Castle 等［9］通過對爪蟾胚胎研究發現 bFGF和FGFR1信號的傳導能刺激神經元的分化，從而達到保護神經元的目的。

本實驗通過免疫組織化學染色觀察到，在力竭運動后即刻FGFR1表達明顯增加，推測可能是因為一次性力竭運動導致腦缺血后，FGFR1即可引起神經元和神經膠質細胞的bFGF合成增加，在細胞損傷或死亡后可將bFGF釋放入細胞間隙，進而保護或修復那些表達FGFR1的細胞，這意味著FGFR1的表達可以保護神經元，其與神經細胞存活密切相關。在保護神經元的過程中，FGFR1逐漸被消耗，其表達強度也將逐漸減弱，這與本試驗中在運動后12 h、運動后24 h和運動后48 h表達強度依次下降相吻合。FGFR1的陽性表達強度在力竭運動后明顯增強，是細胞對缺血缺氧損傷的一種協調反應，是神經細胞的一種自我保護機制，通過這種機制來減輕損傷程度并促進后期神經功能的恢復，但這種修復作用是部分的、不完全的［10］。所以，在運動后即刻之后的各時段中，FGFR1的陽性表達強度一直呈下降趨勢，即便在神經元可能發生了遲發性損傷時FGFR1并沒有明顯的升高，也與其修復過程不完全一致。

3.3 bFGF與FGFR1相關性的可能機制

FGFR1是bFGF的高親和力受體，廣泛地分布于靶細胞表面，腦損傷后，受損腦組織釋放的內源性bFGF與FGFR1結合才能誘導一系列生物化學反應，觸發信號級聯傳導系統，最終細胞外信號傳入核內，發揮生物學作用，本研究結果支持這種學說。bFGF在與其受體FGFR1結合后，一方面激活FGFR1的酪氨酸激酶的活性。即激活靶細胞內酪氨酸蛋白激酶而促進細胞代謝，同時還能定位于靶細胞核通過影響RNA聚合酶1加強核蛋白體基因的轉錄，加速G0期進入G1期，G1期向G2期轉化，促進細胞分裂，增殖［11］。因為當bFGF與FGFR1結合后，受體活化后信號傳遞過程涉及到一系列蛋白酪氨酸磷酸化，因此酪氨酸磷酸化蛋白活性在一定程度上可以反映bFGF與FGFR1活化水平。另一方面bFGF與FGFR1結合后被內吞至胞內，再被轉運到核內激活核轉錄因子引起核轉錄［12］。bFGF與細胞作用需要有兩個受體:硫酸乙酰肝素蛋白聚糖(heparan sulfate proteoglycans，HSPG)和FGFR1才能完成它的生物學功能。bFGF釋放出胞外后，先于HSPG結合，再移至細胞表面，與FGFR1結合形成一個類似于三明治的結構，bFGF被夾在當中。bFGF與FGFR1結合后導致FGFR1形成二聚體，催化自身形成磷酸化，從而激活其TK的活性，引發信號傳遞。bFGF與HSPG有高親和力。雖然有報道說bFGF分泌到胞外后不需要HSPG也能和FGFR1結合，而且對生物學功能沒有大的影響。但是實驗證明，如果bFGF如果沒有HSPG的協助，bFGF與FGFR1的結合力大大降低［13］。

本實驗結果顯示，在一次性力竭運動后，bFGF及FGFR1在大體上呈明顯的相關性，其機制可能是因為bFGF與細胞作用需要與FGFR1結合才能完成它的生物學功能。同時，在運動后24 hbFGF呈上升趨勢而FGFR1呈下降趨勢，并沒有相關性，其機制可能是因為bFGF與細胞作用除了FGFR1以外，還需要與HSPG結合才能完成它的生物學功能。bFGF與HSPG有高親和力，HSPG一般在腦缺血后12～24 h達最大值，這與本試驗中bFGF的陽性表達在運動后24 h組的上升趨勢大體上相一致。我們發現bFGF和FGFR1的陽性細胞分布大部分區域互相重疊。同時，bFGF和FGFR1表達的時間規律大體上吻合，均在運動后即刻增高到最大值，之后呈遞減趨勢，反映了bFGF與FGFR1在功能上互相協調。

4 結論

1)一次性力竭運動能夠引起大鼠海馬bFGF在神經元損傷階段的高表達，提示bFGF可能與運動性中樞疲勞的消除有關。在運動后24小時表達較高，推測由于發生遲發性神經元損傷所致。

2)一次性力竭運動能夠引起大鼠海馬FGFR1在神經元損傷階段的高表達，并且在恢復階段末期下降，證實了FGFR1可能輔助bFGF參與對神經元的保護作用。

3)一次性力竭運動后bFGF與FGFR1大體上呈明顯的正相關，提示FGFR1有促進bFGF表達的功能。

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