參膠生血顆粒質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的研究

龐宇?陸石英

[摘要] 目的 建立參膠生血顆粒的質(zhì)量控制方法。 方法 采用薄層色譜法對(duì)人參、黃芪、首烏進(jìn)行定性鑒別；用HPLC-ELSD法測(cè)定黃芪甲苷的含量。 結(jié)果 薄層色譜斑點(diǎn)清晰集中，易于鑒別；黃芪甲苷進(jìn)樣量在0.021～0.063 ?g范圍內(nèi)線性關(guān)系良好（r=0.9998），平均加樣回收率為98.95%（RSD=1.27）。 結(jié)論 本方法靈敏、準(zhǔn)確、重現(xiàn)性好、專屬性強(qiáng)，可作為參膠生血顆粒的質(zhì)量控制提供依據(jù)。

[關(guān)鍵詞] 參膠生血顆粒；質(zhì)量控制；薄層色譜；含量測(cè)定

[中圖分類號(hào)] R286.0 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 2095-0616（2013）06-98-03

參膠生血顆粒由人參、黃芪、丹參、制首烏、枸杞子等組成的醫(yī)院復(fù)方制劑。補(bǔ)氣生血，益精天髓，能有效促進(jìn)血細(xì)胞的生成，提高免疫力。適用于氣血虛弱諸癥，貧血癥，產(chǎn)后、病后身體虛弱，腫瘤患者放、化療后白細(xì)胞減少等。原質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)只做了黃芪的鑒別，為了更有效地控制參膠生血顆粒的質(zhì)量，本文對(duì)處方中人參、黃芪、制首烏進(jìn)行薄層色譜鑒別， HPLC-ELSD測(cè)定黃芪甲苷的含量，并對(duì)本實(shí)驗(yàn)進(jìn)行方法學(xué)研究。黃芪甲苷含量測(cè)定的方法主要有薄層掃描法、高效液相紫外法、高效液相-蒸發(fā)光散射法[1-3]。本文用高效液相-蒸發(fā)光散射法對(duì)黃芪甲苷進(jìn)行含量測(cè)定，結(jié)果準(zhǔn)確，重現(xiàn)性好，適用于本制劑對(duì)黃芪的質(zhì)量控制。

1 資料

1.1 儀器

儀器 LC-2010高效液相色譜儀（日本島津公司），MODEL400-蒸發(fā)光檢測(cè)器（美國(guó)soft公司）；BP211D電子天平（德國(guó)塞多利斯儀器公司）；YOKO-ZS 紫外線分析攝影儀（武漢藥科新技術(shù)開發(fā)有限公司）。

1.2 試藥

乙腈為色譜試劑（Fisher公司），水為重蒸餾水，其試劑均為分析純。硅膠G薄層板（自制硅膠G板，青島海洋化工廠，Merck公司）人參皂苷Rg1 （含量測(cè)定用，批號(hào)0862-9903）、黃芪甲苷（含量測(cè)定用，批號(hào) 110781-200613），何首烏對(duì)照藥材（鑒別用，批號(hào)110703-200424），以上對(duì)照品和對(duì)照藥材均由中國(guó)藥品生物制品檢定所提供。參膠生血顆粒（廣西醫(yī)院藥劑科，批號(hào)20080510、20080920、20091124）。

2 方法和結(jié)果

2.1 人參、黃芪的薄層色譜鑒別[4]

2.1.1 供試品溶液配制 取本品，研細(xì)，稱取粉末1 g，加甲醇100 mL，加熱回流提取3 h，放冷濾過(guò)，濾液蒸干，殘?jiān)盟?0 mL溶解，轉(zhuǎn)移至分液漏斗中，用水飽和的正丁醇振搖提取3次，每次20 mL，合并正丁醇提取液，用氨試液洗滌2次，每次20 mL，正丁醇液蒸干，殘?jiān)盟?0 mL溶解，濾過(guò)，濾液通過(guò)D101型大孔吸附樹脂柱（內(nèi)徑為1.5 cm，柱高為12 cm），先后用水50 mL、40%乙醇30 mL和70%乙醇50 mL洗脫，收集70%乙醇洗脫液，蒸干，殘?jiān)蛹状?.5 mL使溶解，溶液備用。

2.1.2 對(duì)照品溶液配制 取人參皂苷Rg1對(duì)照品及黃芪甲苷對(duì)照品，分別加甲醇制成每毫升含1 mg的溶液，作為對(duì)照品溶液備用。

2.1.3 陰性對(duì)照溶液配制 制備方法和制備過(guò)程參照上述供試品溶液的制法。

2.1.4 鑒別試驗(yàn) 參照中國(guó)藥典2010年版一部附錄VIB中關(guān)于薄層色譜法標(biāo)明的具體鑒別方法，吸取上述3種溶液各5～10 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以正丁醇-乙酸乙酯-水（4︰1︰5）的上層溶液為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，在105℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰，置日光燈下檢視。供試品色譜中，在與對(duì)照品色譜相應(yīng)位置上，分別顯相同顏色的斑點(diǎn)，陰性對(duì)照無(wú)對(duì)應(yīng)的斑點(diǎn)。見圖1。

1.供試品（20080510）；2.供試品（20080920）；3.人參皂苷Rg1；4.黃芪甲；5-缺人參、黃芪的陰性樣品

2.2 制首烏的薄層色譜鑒別[4]

2.2.1 供試品溶液配制 取本品2 g，研碎，加甲醇20 mL，超聲處理15 min，濾過(guò)，用少量甲醇洗滌藥渣，濾過(guò)，合并濾液使成20 mL，取濾液10 mL，蒸干，殘?jiān)尤燃淄? mL使溶解，作為供試品溶液，備用。

2.2.2 對(duì)照藥材溶液配制 取何首烏對(duì)照藥材2 g，依據(jù)上述供試品溶液的制備方法同法制成對(duì)照藥材溶液；取適量的大黃素對(duì)照品，用甲醇溶解制成0.5 mg/mL溶液備用。

2.2.3 陰性對(duì)照溶液的配制 制備方法和制備過(guò)程參照上述供試品溶液的制法。

2.2.4 鑒別試驗(yàn) 參照中國(guó)藥典2010版一部附錄 VIB 中關(guān)于薄層色譜法標(biāo)明的具體鑒別方法，吸取上述兩種溶液各2 μL，分別點(diǎn)于同一用0.5%氫氧化鈉溶液制備的硅膠G薄層板上，以甲苯-乙酸乙酯-甲酸（15︰2︰1）為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外光燈（365 nm）下檢視。供試品色譜中，在與對(duì)照藥材色譜及對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同的橙色熒光斑點(diǎn)；置氨蒸氣中熏后，斑點(diǎn)變成紅色，見圖2。

1.供試品（20080510）；2.供試品（20080920）；3.供試品（20091124）；4.大黃素；5.何首烏對(duì)照藥材；6.缺何首烏的陰性樣品

2.3 含量測(cè)定

2.3.1 色譜條件與系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn) 采用Agilent C18（4.6 mm× 250 mm，5 μm）色譜柱，流動(dòng)相：乙腈-水（32︰68），流速： 1.0 mL/min，蒸發(fā)光檢測(cè)器。柱溫： 30℃， 進(jìn)樣量：20 μL。在本條件下，黃芪甲苷能達(dá)到較好分離，樣品其他成分對(duì)測(cè)定無(wú)干擾。見圖3。可見以甲醇-水，乙腈-水為流動(dòng)相進(jìn)行考察，甲醇-水為流動(dòng)相時(shí)出現(xiàn)很多干擾峰，而以乙腈-水為流動(dòng)相時(shí)干擾明顯減少，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，乙腈-水（32︰68），基線平穩(wěn)，噪聲干擾少，色譜鋒型較好。

A.黃芪甲苷對(duì)照品；B.供試品；C.陰性對(duì)照

2.3.2 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取黃芪甲苷對(duì)照品適量，加甲醇溶解并制成0.1050 mg/mL，的對(duì)照品溶液。

2.3.3 供試品溶液的制備 供試品溶液的制備 取本品適量研細(xì)，稱取4 g，精密稱定，置索氏提取器中，加甲醇40 mL，冷浸過(guò)夜，再加甲醇適量，加熱回流4 h，提取液回收溶劑并濃縮至干，殘?jiān)铀?0 mL，微熱使溶解，用水飽和的正丁醇振搖提取4次，每次40 mL，合并正丁醇液，用氨試液充分洗滌2次，每次40 mL，棄去氨液，正丁醇液蒸干，殘?jiān)铀? mL使溶解，放冷，通過(guò)D101型大孔吸附樹脂柱（內(nèi)徑1.5 cm，長(zhǎng)12 cm），以水50 mL洗脫，棄去水液，再用40%乙醇30 mL洗脫，棄去洗脫液，繼用70%乙醇80 mL洗脫，收集洗脫液，蒸干，用甲醇溶解并轉(zhuǎn)移至5 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，備用。

2.3.4 線性關(guān)系的考察 精密量取黃芪甲苷對(duì)照品溶液（0.1050 mg/mL）2.0、3.0、4.0、5.0、6.0置10 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度搖勻，分別精密吸取5、10 μL注入液相色譜儀，記錄色譜。以進(jìn)樣量的對(duì)數(shù)（X）對(duì)峰面積的對(duì)數(shù)（Y）進(jìn)行線性回歸，得黃芪甲苷的回歸方程為Y=3.782032X+1.206451，r=0.9990。在（0.021～0.063 μg）范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系。

2.3.5 精密度試驗(yàn) 精密吸取對(duì)照品溶液10 μL，重復(fù)進(jìn)樣5次，記錄峰面積。結(jié)果黃芪甲苷的峰面積的RSD 為1.6%。

2.3.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取參膠生血顆粒樣品（批號(hào)20080510）的供試品溶液，分別于（0、2、4、8、12、24 h）進(jìn)樣20 μL記錄峰面積，結(jié)果黃芪甲苷的峰面積的RSD分別為2.2%、2.5%、2.8%（n=6），表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.3.7 重現(xiàn)性試驗(yàn) 取同一批次的參膠生血顆粒各5份，按供試品制備方法制備成供試品溶液，注入色譜儀，記錄峰面積，計(jì)算含量。結(jié)果黃芪甲苷含量平均值（n=5）分別為0.024 54 mg/g、 0.024 12 mg/g、 0.024 28 mg/g；RSD分別為1.9%、2.5%、2.2%。

2.3.8 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取已知含量的參膠生血顆粒（20080510）黃芪甲苷含量0.024 54 mg/g），精密加入黃芪甲苷對(duì)照品溶液（ 0.1050 mg/mL）0.6、0.7、0.8 mL按供試品溶液制備方法制備，注入色譜儀，記錄測(cè)定，測(cè)定結(jié)果見表1。

2.3.9 樣品測(cè)定 分別取3批參膠生血顆粒樣品，按2.2.3項(xiàng)下方法制備供試品溶液。分別精密吸取2.2.2項(xiàng)下的混合對(duì)照品溶液10 μL及供試品溶液20 μL進(jìn)樣，記錄峰面積，以外標(biāo)兩點(diǎn)法對(duì)數(shù)方程計(jì)算黃芪甲苷的含量，結(jié)果見表2。

3 討論

本實(shí)驗(yàn)建立的舒血靈質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的研究與原有的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)相比增加了人參、何首烏和女貞子的薄層鑒別及黃芪的含量測(cè)定，其中黃芪的含量測(cè)定已收載在中國(guó)藥典2010年版一部[5-6]。本文直接采用藥典方法。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，該方法簡(jiǎn)便易行，結(jié)果準(zhǔn)確，重現(xiàn)性好，適用于本制劑對(duì)黃芪的質(zhì)量控制。

3.1 對(duì)提取方法的考察[7]

比較索氏提取法和超聲提取法，以不同的提取時(shí)間進(jìn)行對(duì)比，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，采用索氏提取法的提取率更高。

3.2 對(duì)提取時(shí)間的考察

對(duì)同一樣品用甲醇索氏提取，以1、2、3、4和5 h不同時(shí)間進(jìn)比較，提取4 h與5 h的結(jié)果含量、回收率差異無(wú)顯著性。故選本法提取。

3.3 對(duì)流動(dòng)相的考察[8]

以甲醇-水，乙腈-水為流動(dòng)相進(jìn)行考察，甲醇-水為流動(dòng)相時(shí)出現(xiàn)很多干擾峰，而以乙腈-水為流動(dòng)相時(shí)干擾明顯減少，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，乙腈-水（32︰68），基線平穩(wěn)，噪聲干擾少，色譜鋒型較好。

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（收稿日期：2013-02-18）