“原生質體的培養”一節研究性教學案例

中圖分類號：G423 文獻標志碼：A 文章編號：1674-9324（2013）37-0173-02

【教材分析】

高等植物細胞和動物細胞最大的區別在于外有一層細胞壁，原生質體是基礎研究的理想材料，原生質體融合技術已成為作物改良的最有效的工具之一。在實現植物細胞融合之前必需獲得再生能力強、活性高的原生質體，同時原生質體比較“脆弱”，培養條件和影響因素很多，因此通過這一節的學習要讓學生掌握原生質體培養的方法和原理，原生質體培養過程中可能會出現的問題及如何解決。

【學情分析】

本科二年級已學過《細胞生物學》和《植物生理學》課程，對植物細胞的結構和植物細胞生長所需基本元素有所了解，這為本節教學奠定了基礎。在此基礎上，進一步了解原生質體培養方法、條件、注意事項等，為下一節“原生質體融合”課作好鋪墊。

【教學目標】

知識目標：掌握原生質體的制備方法和培養條件。

能力目標：通過研究性教學和實踐，加強學生對細胞工程實驗原理和方法的遷移能力和創新能力的培養，提高學生動手和解決問題的能力，更好地適應社會的需要。

情感目標：在學生討論與交流的基礎上進行研究性教學，通過課堂講授、提問、交流、討論以及實驗數據的分析等培養學生解決細胞工程教學中理論和實踐相結合的能力，從而激發學生學習生物技術和細胞工程的興趣。

【教學手段】

教師講授、分組討論、模擬實驗和實驗設計相結合的方法。

【教學重點】

原生質的制備以及培養條件。

【教學過程】

一、課前預習

1.什么是植物細胞培養？

植物細胞培養是指在離體培養條件下，將植物愈傷組織或其他易分散的組織置于液體培養基中，通過振蕩培養分散成游離的懸浮細胞，繼代培養使細胞增殖，獲得大量細胞群體的一種技術。

2.植物細胞壁的主要成分是什么？

（1）纖維素，占細胞壁干重的25%～50%不等；（2）半纖維素，平均約占細胞壁干重的53%左右；（3）果膠質，一般占細胞壁的5%。

二、課堂教學

【問題1】植物細胞和動物細胞不同，外面有一層細胞壁，如何獲得去壁的裸露的植物細胞？這就是我們說的原生質體。

【學生討論環節】

【老師小結】第一種方法是用機械切割的方法，第二種方法是通過酶解的方法。酶解方法的原理是植物細胞壁的主要成分是纖維素、半纖維素和果膠質，使用纖維素酶、半纖維素酶和果膠酶可以降解細胞壁成分，獲得裸露的植物細胞，即原生質體。

【問題2】細胞壁對植物細胞有保護作用，如果用酶解的方法去除細胞外面的細胞壁，如何才能保持細胞不會破裂？

【學生討論環節】培養液中加入一種滲透穩定劑，保持原生質體膜的穩定，避免破裂。

【老師小結】是的，通常有二種方法來保持滲透平衡：

（1）糖溶液系統：包括甘露醇、山梨醇、蔗糖和葡萄糖等成分；（2）鹽溶液系統：KCl、KH2PO4和MgSO4等成分。

【問題3】用酶學的方法獲得原生質體取材的時候有什么考慮？

【學生討論】選取生長旺盛的組織來作為實驗材料，如無菌試管苗葉片、下胚軸和子葉、培養細胞等。

【實驗演示】原生質體制備過程和儀器設備

儀器和設備：離心機，無菌培養皿，離心管，無菌操作臺。

試劑：酶液，洗液，液體培養基。

【研究探索】在原生質體分離過程中，有酶解、離心，如何檢測收集到原生質體的活性？請同學們根據已有的知識，在討論的基礎上，寫出你們的實驗方案。針對下列問題開展討論：

（1）如何設計實驗方案？（2）如何測定原生質體的活性？

【學生分組參與】

1.目測法：通過顯微鏡的觀察，根據細胞形態和流動性來確定所分離的原生質體活力。

2.伊凡藍法：伊凡藍這種物質不能自由穿過質膜，只有當質膜受到嚴重損壞的時候細胞才能被染色，所以通過細胞是否被染色來確定分離的原生質體活性。

3.FDA法：二乙酸熒光素（FDA）是一種非極性化學物質，可以自由地穿越細胞質膜，在活細胞內FDA被酯酶裂解可以發出熒光，由于熒光素不能自由通過質膜，在熒光顯微鏡下通過觀察具熒光的細胞來確定所分離的原生質體活性。

【問題4】影響所分離的原生質體活性的因素有哪些？

【師生】結合上述分離方法，對影響因素進行分析

1.實驗所用材料的生理狀態和幼嫩程度；

2.酶解條件：酶的質量和濃度，酶解溫度和時間，酶溶液的滲透壓等；

3.分離條件：離心的次數和速度、純化方法和分離所持續的時間長短；

4.環境條件：實驗操作過程中環境的溫度以及分離用具等。

【問題5】如何對收集到的原生質體進行計數？

【生活實例】平時你感冒的時候醫生要對你血細胞進行計數。

所用儀器：計數器，顯微鏡。

【師生探索】

1.需要測量和記錄哪些實驗數據？

【學生參與】通過計數每一個大方格里的原生質體數，移動不同視野求3個方格（紅色）分別的計數，求其平均數。學生動手計數并算出平均數。

2.如何通過計數器來換算原生質體的密度？

【老師】通常原生質體在104個/mm3條件上生長的比較好，如何通過計數來調節原生質體的密度？

【學生參與】計數器上顯示方格的深是0.1mm，面積是0.0025mm2，一個方格的體積是0.1×0.0025=0.00025mm3，如圖所示，如果在紅色方格中有10個原生質體，它密度就是10/0.00025mm3=4×104/mm3，現在所得到的密度要比理想生長的大4倍，如何處理？

【學生】用培養液來稀釋4倍。

【問題6】如何進行培養，培養條件如何？

【老師】原生質體培養方法

（1）液體淺層培養；（2）固體培養；（3）液體—固體雙層培養。

培養基的成分：

1.無機鹽：大量元素濃度；NO3-和NH4+的比例；Ca2+濃度。

2.有機成分：維生素、氨基酸、糖及糖醇等，酵母提取物、水解酪蛋白。

3.激素：常用的激素：NAA、IAA、6-BA與2，4-D。

4.pH值。

三、課后拓展

1.你是否想到有其他原生質體培養方法和技術？

2.實驗中有哪些因素可能會影響原生質的分離效果？你如何減少這些因素的影響？為了減小實驗誤差和污染的可能性，在實驗中應注意哪些環節和問題？

四、教學反思

“探究型教學法”目的是讓學生在學習知識的同時拓展學生的思維能力和提高他們的創新能力，通過探究性教學為學生能力的提升創造良好的環境。在日常教學過程中，不同個體之間存在著差異。學生所設計的實驗方案和技術路線有可能不夠完美，甚至是錯誤的。如何解決學生在實驗操作過程中的不規范，從而導致原生質培養過程中的污染。但每個學生通過參與了原生質制備全過程，對所學的知識理解更透徹，記憶更持久，尤其是變被動地接受理論知識為主動去探究新的知識。學生的學習興趣、注意力和科學態度就在無意中得到培養。當然，教師應該根據課程內容靈活加以應用，每章安排一些“探究型教學課”來引導學生去自由探索，對活躍課堂氣氛，提高學生的實驗動手能力、思維能力、創新能力，培養學生學習細胞工程以及生物技術的興趣以及和團隊協作的精神有極大的好處。

基金項目：揚州大學教改課題（YZUJX2012—25B）

作者簡介：王幼平（1965-），教授，主講本科生《植物細胞工程與技術》。