變性梯度凝膠電泳技術在微生物實驗教學中的應用

摘要：自然界大部分微生物是未培養微生物，變性梯度凝膠電泳（DGGE）是一種不依賴微生物培養的技術，本文介紹了其原理、流程和在微生物研究性實驗教學中的應用，通過開設DGGE在微生物群落結構分析中的應用等研究性實驗項目，不僅增加了學生對微生物多樣性和群落結構變化的認識，而且有效地激發了其學習興趣，促進了學生分析問題、解決問題能力的培養和提高。

關鍵詞：變性梯度凝膠電泳；微生物實驗；實驗教學改革

中圖分類號：G462 文獻標志碼：A 文章編號：1674-9324（2013）39-0247-02

微生物學是高等院校生物類專業的一門重要專業基礎課，是一門實驗性和應用性很強的學科。微生物學實驗是微生物學的重要組成部分，是現代生物學技術的重要基礎，對于學生加深理論知識的理解，培養創新與實踐能力具有非常重要的作用[1]。傳統的微生物實驗教學內容一般以驗證性和演示性為主，注重培養學生的基本實驗技能，但對學生綜合實驗技能和創新能力的培養有待提高。隨著國家對創新人才的需求，適當增加綜合性和研究性實驗內容的比重是微生物實驗教學改革的發展方向，對于提高學生的思維能力、動手能力有著積極的作用[1-3]。

本校非常重視實驗教學改革工作，鼓勵學生在掌握基本實驗技能后，積極參加設計性、研究性實驗，包括院校兩級的大學生科研立項或教師的研究課題，并給予相應的創新學分。通過該項措施進一步激發了學生的學習興趣，并有效提高了學生的實驗技能及分析問題和解決問題的能力。目前微生物實驗教學主要包括傳統的微生物實驗技術，隨著分子生物技術的發展，微生物研究技術突破了以往主要依賴純培養物的局限性，特別是在生態環境樣品中的微生物群落結構分析中，基于PCR擴增的分子生物學方法逐漸取代了傳統的培養方法，大大拓展了微生物研究的范圍[4]。因此，我們在后續的研究性實驗中引入了變性梯度凝膠電泳在微生物群落結構分析中的應用等創新型實驗項目，使實驗教學從基礎性向綜合性和研究性推進。

一、變性梯度凝膠電泳（DGGE）技術概述

由于自然環境中微生物生存條件的復雜性，大多數微生物以未可培養的形式存在。DGGE是一種不依賴微生物培養技術的研究方法，能快速、準確鑒定環境中微生物種群，在揭示復雜微生物群落演替規律和功能基因多樣性方面具有獨特的優越性，已被廣泛應用于微生物分子生態學研究各領域[5]。DGGE技術的基本原理是在聚丙烯酰胺凝膠的基礎上，加入呈梯度分布的變性劑（甲酰胺及尿素），雙鏈DNA分子部分解鏈導致電泳遷移率降低，而序列不同的DNA分子解鏈行為不同，在凝膠中的移動速度也就不同，從而使得長度相同而序列不同的DNA片段分離。因此，通過測序分析凝膠上不同的譜帶，可以檢測微生物種群的遺傳多樣性和動態變化[6]。DGGE技術的工作流程主要包括以下幾個步驟：（1）環境樣品的采集；（2）樣品中微生物基因組DNA的提取；（3）DNA片段的PCR擴增；（4）PCR產物的DGGE分析；（5）DNA條帶的序列分析。

二、變性梯度凝膠電泳技術在微生物實驗教學中的應用

變性梯度凝膠電泳技術是一項綜合性較強的實驗技術，涉及的知識面較廣，要求學生既要有全面扎實的理論知識，又要求較強的實際動手能力。我校的微生物學實驗安排在大學二年級的上學期，通過學習使學生掌握微生物學實驗的基本原理和操作技術。此外通過后續的生化分析技術和分子生物學實驗等課程，學生掌握了聚丙烯酰胺凝膠電泳、基因組提取和PCR擴增等實驗技術。因此該項研究性實驗項目主要面向大學二年級和三年級的學生，我們為學生提供開放的實驗室環境，學生自己組成實驗小組，可根據自己的實際情況安排時間。整個實驗由學生實驗小組開展并完成，同時在實施過程中配備指導教師進行隨時指導。根據學生的學習興趣并結合實驗室的科研課題，我們近幾年開設了多項DGGE技術在微生物研究中應用的實驗，包括《氯嘧磺隆對土壤微生物類群的影響》、《SBR反應器中聚磷菌群的結構分析》、《不同森林土壤中產漆酶細菌群落結構的研究》和《厭氧污泥對偶氮廢水的脫色及污泥菌群結構分析》等研究性實驗項目。環境樣品中DNA的提取是影響微生物多樣性的DGGE檢測結果的重要因素[7]，學生通過比較不同提取方法對DNA產量和純度的影響，確定了針對不同的實驗樣品（土壤或污泥）的最佳提取方法，在這一過程中加深了對DNA提取原理和方法的認識。通過DGGE圖譜的分析，學生可以直觀地了解到污染脅迫等環境條件下微生物群落結構的改變及優勢菌群形成的動態過程，更加深刻地理解富集培養技術在分離特定功能微生物上的應用。學生通過后續的序列比對分析，可以學習到相關環境中常見的微生物優勢菌屬，特別是一些非培養微生物序列的出現豐富了學生對微生物多樣性的認識。通常面向本科生開設的微生物實驗主要以好氧微生物為對象，因此學生接受的微生物學知識側重于好氧微生物，對厭氧微生物的接觸和認識較少。我們通過引入厭氧環境中微生物結構分析等實驗項目，使學生有機會接觸厭氧箱的使用，掌握厭氧微生物的培養方法等實驗內容，進一步豐富實驗教學內容，深化實驗教學改革。

三、小結

分子生物學技術的發展，展示了一個更為豐富的微生物世界。與目前基于高通量測序的微生物多樣性分析方法相比，DGGE技術具有快捷、方便、成本低等優點，適合應用于微生物創新實驗教學。通過這些研究性實驗的開展，使學生完成無法在正常教學時間進行的實驗內容，拓展了與其他學科實驗技術的綜合應用，在激發學生學習興趣的同時，不僅提升了學生的實驗操作技能和團隊協作能力，而且增強了綜合思考及分析解決問題的能力，為獨立完成畢業論文實驗及今后從事科研工作打下了堅實的基礎[8]。

參考文獻：

[1]張萍華，蔣冬花.微生物學創新實驗教學體系的構建與實踐[J].微生物學雜志，2013，32（3）：107-109.

[2]袁生，徐旭士，戴傳超，何偉，張茵，尚廣東，戴亦軍.微生物學實驗課程的改革與實踐[J].高等理科教育，2012，（2）：138-140.

[3]賈艷萍，張蘭河，馬姣.立足學科發展的微生物學實驗教學改革研究[J].實驗技術與管理，2012，29（12）：26-32.

[4]李曉然，呂毅，宮路路，柳陳堅.微生物分子生態學發展歷史及研究現狀[J].中國微生態學雜志，2012，24（4）：366-369.

[5]李琬，李景鵬.分子生物學技術在堆肥微生態研究中的應用研究進展[J].中國農學通報，2012，28（18）：20-25.

[6]王洋清，楊紅軍，李勇.DGGE技術在森林土壤微生物多樣性研究中的應用[J].生物技術通報，2011，（5）：75-79.

[7]高慧琴，劉凌.PCR-DGGE技術中不同DNA提取方法綜述[J].安徽農業科學，2011，39（1）：52，102.

[8]高健，周建良，蔣本桂，張潔.普通微生物實驗教學全面開放理論的建構[J].當代教育理論與實踐，2012，4（3）：113-114.

基金項目：東北林業大學微生物學重點課程建設項目；東北林業大學教育研究課題項目（DGY2011-15）；東北林業大學教育教學研究課題（DGY2012-10）

作者簡介：盧磊（1982-），男，講師，博士，主要研究方向為環境微生物。