EML4-ALK融合基因在非小細胞肺癌的研究新進展

李 龍

(長江大學醫學院，湖北荊州434023)

王 夢，杜天幸 蔡志強，楊繼元

(長江大學臨床醫學院 荊州市腫瘤醫院，湖北荊州434000)

肺癌是全球惡性腫瘤導致死亡的最主要原因，每年有超過100萬人死于肺癌［1］。肺癌全球每年新增病例約160萬，其中非小細胞肺癌 (NSCLC)約占80%。雖然化療仍是晚期肺癌治療的主要方法之一，但其副作用大，且療效已遇瓶頸。隨著EGFR、VEGFR等研究的不斷深入，以這些特殊分子的靶向治療，因其毒性小，療效突出，現已成為肺癌治療的新熱點。近幾年在非小細胞肺癌發現的棘皮動物微管相關蛋白樣4和間變淋巴瘤激酶融合基因 (EML4-ALK)可能成為繼EGFR、VEGFR后新的研究熱點。現就EML4-ALK的結構及亞型、檢測方法、針對該靶點的最新治療情況以及耐藥狀況進行綜述。

1 EML4-ALK融合基因的結構及亞型

棘皮動物微管相關蛋白樣4(EML4)與間變淋巴瘤激酶兩基因均位于2號染色體短鏈，分別為P21與P23。2007年，Soda1［2］等將一腺癌患者手術腫瘤切除組織進行擴增，在產物中發現一3296bp組成的DNA，其編碼由1059個氨基酸組成的蛋白質。研究人員對其蛋白質進行分析發現其N端為EML4編碼蛋白的一部分，C端為ALK編碼蛋白一部分。故推測其為兩基因的融合蛋白。Lin［3］等研究發現EML4-ALK融合基因陽性非小細胞肺癌細胞株通過siRNA基因敲除沉默后其生長受抑制，表明ELM4-ALK融合基因具有致癌作用。

到目前為止有超過9個不同的EML4-ALK融合基因變體已經被確認。融合基因的ALK段固定，均為20-29外顯子片段，與EML4外顯子13融合成變體1(variant1)。它與EML4外顯子20融合成變體2(variant2)。它與外顯子6融合成變體3a(variant3a)，外顯子6及11個氨基酸插入形成變體3b。外顯子14及14個未知來源的核苷酸插入至ALK外顯子核苷酸50序列區形成變體4(variant4)。它與EML外顯子2形成變體5(variant5)，與外顯子13形成變體6(variant6)。外顯子14融合至ALK核苷酸13序列區形成變體7(variant7)，外顯子15與ALK融合形成變體8(variant7)，外顯子18與ALK融合形成變體9(variant9)［4］。9種變體中，最長見的是變體1與變體3，分別占到33%和29%。不同變體在非小細胞肺癌中的作用機制及其作用強度是否有區別暫時沒有報道。

2 NSCLC中的EML4-ALK

Gung Jin［5］等用 RT-PCR對167例肺癌標本 (121例腺癌，46例鱗癌)進行研究，發現10例(6%)EML4-ALK融合基因陽性，陽性病例在年輕患者更常見 (10.8%VS89.2%，P=0.002)，融合基因更集中表現在女性、非吸煙、腺癌患者中。10例EML4-ALK患者的EGFR、KRAS均為野生型，其中8例為EML4-ALK變體1型，2例為變體3型。

Aliced［6］等采用熒光原位雜交對141例NSCLC病例 (89例腺癌、41例細支氣管肺泡癌、4例腺鱗癌、2例鱗癌、5例大細胞癌)進行研究，發現19例 (13%)EML4-ALK融合基因陽性，31例 (22%)EGFR突變型，91例EGFR、EML4-ALK雙野生型。對EML4-ALK融合基因陽性患者與EGFR突變型以及雙野生型比較，三組平均年齡分別是52、66、64歲，EML4-ALK融合基因陽性患者更年輕 (P＜0.001，P=0.005)。EML4-ALK融合基因陽性患者與EML4-ALK、EGFR雙野生型患者比較，EML4-ALK(+)更傾向發生在不抽煙者 (P＜0.001)。EML4-ALK(+)患者其EGFR基因型均為陰性，沒有重疊。

Wong［7］等采用RT-PCR及免疫組化對266例 NSCLC患者進行分析 (adenocarcinomar209例、lymphatic epithelial carcinoma11例、squamous cell carcinoma 34例、mucosal epithelia carcinoma 12例)發現EML4-ALK融合基因13例 (4.9%)，其中吸煙者1例，不吸煙者12例，EML4-ALK(+)更傾向發生于不抽煙者 (P=0.009)，EML4-ALK(+)與EGFR(+)及KRAS(+)不重疊。EML4-ALK(+)平均年齡為59歲，EML4-ALK(-)平均年齡為64歲，EML4-ALK融合基因更傾向于發生年齡較輕者(P ＜0.018)。

EML4-ALK融合基因更傾向于發生于肺腺癌，但鱗癌、肺鱗癌、大細胞癌均有研究者報道，不吸煙、年輕、女性的、EGFR(-)、KRAS(-)群體其EML4-ALK發生率更高。

3 EML4-ALK融合基因的檢測方法

3.1 逆轉錄聚合酶鏈反應 (RT-PCR)

RT-PCR在檢測NSCLC EML4-ALK融合基因方面具有敏感性高的特點，但往往醫院的病理標本均經甲醛固定，其細胞內RNA被大量破壞，導致其靈敏性降低。逆轉錄聚合酶鏈反應一般采用單管多重技術，所以其對未知亞型無法檢出［8］。并且采用PCR技術假陽性結果幾率較其他方法幾率增大［9］。

3.2 免疫組化 (IHC)

免疫組化是實驗室經典的蛋白質檢查方法，其應用于EML4-ALK融合基因的檢測主要原理是檢查融合基因表達蛋白。IHC檢驗結果與RT-PCR及FISH具有高度重疊性。但由于EML-ALK基因在肺組織表達不足［10］，低表達的EML-ALK往往被漏檢，再者IHC不能對融合基因進行亞型分型［11］。

3.3 熒光原位雜交 (fluorescence in sure hybridization，FISH)

熒光原位雜交是采用基因探針來標記ALK兩斷裂端，如果為EML4-ALK融合基因，熒光顯微鏡下顯現綠色和紅色，如果為融合基因陰性，在熒光顯微鏡下顯現黃色［12］。在采用免疫組化檢測時，如果EML4-ALK融合基因表達弱陽性，IHC檢測結果為陰性，若使用FISH檢測法為陽性。由于FISH法的病理標本均經甲醛固定石蠟包埋，其細胞組織、細胞結構廣泛被破壞，易出現假陽性。Thunnissen［13］等研究發現經免疫組化檢測為陽性采用FISH檢測假陰性。

3.4 其他方法

現在沒有檢測EML4-ALK的金標準，RT-PCR、IHC、FISH各有利弊，IHC與FISH不能區分亞型變體，RT-PCR理論上可以區分已知亞型，但是不能檢測出未知亞型。RACE-PCR技術解決了RT-PCR不能區分未知亞型變體的問題，并且能檢測出其他與ALK融合的基因［14］。

4 針對EML4-ALK融合基因的治療現狀

ALK與EML4基因融合后，導致ALK胞內酪氨酸酶區持續活化，促進細胞的增殖，導致細胞癌變。這為研發阻斷ALK受體，阻止其持續活化的分子靶向藥物提供了理論基礎。Soda［2］等研究發現肺上皮細胞表達EML4-ALK融合基因的轉基因小鼠最終發展成肺腺癌，表明ALK融合基因具有癌基因特性。不同研究均發現，在NSCLC表達EML4-ALK融合基因的細胞株進行研究，ALK抑制劑可以通過抑制ALK融合基因的相關信號通路起到抑癌作用［15-16］，其抑癌機制與EGFR抑制劑類似。ALK抑制劑已經在體內進行評估起到良好的療效，并且作用于產生EML4-ALK的非小細胞肺癌的異種移植小鼠，導致腫瘤的有效消退。PF-02341066(crizotinib)是目前唯一進入III期臨床試驗的藥物［17］，這種口服的生物可利用的小分子抑制劑已被證明能夠抑制EML4-ALK(+)細胞株。GSK2141795現已經進入一期臨床階段，NVP-TAE684、CEP-28122、AP-26113、NMS-E628已進入臨床前試驗。

Lazarev I［18］等診治一36歲非吸煙的非小細胞肺癌，化療失敗，EML4-ALK融合基因陽性，后給予Crizotinib口服300mg/日，治療兩月后評價治療緩解。Wang［19］等報道于就診的1500例非小細胞肺癌患者中檢測出含有ALK重排融合基因患者，采用Crizotinib口服治療，如果有效并且穩定則繼續治療，如果疾病進展則停止服藥，其平均治療時間為6.2月。其中CR(完全緩解)數:1例，PR(部分緩解)數:46例，并且NC(并且穩定)數:27例。

Zhang［20］等報道，一非小細胞肺癌患者，檢測EML4-ALK融合基因陽性，口服crizotinib 5月后，發現病情進展，取肺癌組織做基因分析，發現其融合基因有兩處突變 (4374與4493序列區)，基因點突變后，ALK融合蛋白結構發生改變與crizotinib親和力下降。培養crizotinib耐藥癌細胞株，將TAE684作用于此細胞株，發現細胞株生長受抑制。Heuckmann［21］等研究表明不同EML4-ALK融合基因變體對ALK抑制劑的敏感性不同，HSP90對EML4-ALK融合基因陽性非小細胞肺癌細胞系也有抑制作用，與ALK抑制劑一樣，不同變體對其敏感性存在差異性，但其耐受機制不一樣，將ALK抑制劑與HSP90聯合使用，具有更強的抑制效果。

5 結 語

現階段化療及放射治療仍是晚期非小細胞肺癌患者的主要治療手段，但由于其療效欠佳，毒副作用大，人們渴望一理想的治療手段，分子靶向治療是一個不錯的研究方向。EML4-ALK可能是繼EGFR、VEGFR后又一新的治療靶點。目前對于EML4-ALK融合基因的研究我們主要面臨以下幾個問題:①EML4-ALK融合基因發生率低，研究時需要樣本量大，現缺乏大樣本量的研究報告。②RT-PCR、IHC、FISH各有優缺點，聯合檢測可以互補。暫時沒有檢測EML4-ALK的金標準。③EML4-ALK融合基因通路機制尚未完全清楚，它們之間是否相互聯系及權重關系有待進一步研究，待通路機制研究透徹，針對主要通路機制或者聯合通路機制的藥物更具有針對性。以上3個問題將是以后研究的主要方向，以EML4-ALK為治療靶點將是治療NSCLC的新希望。

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