小分子RNA 干擾鞘氨醇激酶1 表達對APP/PS1 小鼠海馬神經元的影響

張 遠，黎 鋼，孫圣剛，喬 嫻

阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)影響了全球1.5×107萬人次，深入了解神經元變性死亡的機制并找到能夠延緩或阻斷該靶點的藥物是AD研究的核心問題。近年來神經鞘脂(sphingolipid)代謝異常與Aβ 的神經毒性作用受到諸多研究者的關注［1～6］。最早研究發現AD 患者腦標本中神經酰胺神經酰胺(ceramide，Cer)含量增增高，He［7］等的研究發現與正常死亡腦組織標本相比較，AD 患者腦標本的額顳區灰質參與神經鞘磷脂(sphingomyelin，SM)、Cer 代謝的酸性神經鞘磷脂酶及神經酰胺酶活性增強，這導致SM 下降、Cer 含量增高、鞘氨醇(sphingosine，Sph)含量增高，但1-磷酸鞘氨醇(sphingosine1-phospate，s1p)含量下降。在此基礎上我們構建了sphk1-siRNA 腺病毒載體，并將其通過立體定位注射的方法轉染至APP/PS1 雙轉基因AD模型鼠海馬。前期研究發現老年斑沉積增多，行為學損害程度顯著惡化［8］，轉染后APP/PS1 雙轉基因小鼠海馬組織凋亡程度明顯增加［9］。在此基礎上我們研究了sphk1-siRNA 轉染后對小鼠海馬DG 區神經元的影響，現將結果匯報如下。

1 材料與方法

1.1 重組腺病毒載體sphk1-siRNA 的構建重組質粒pDC316 sphk1-siRNA 的構建及病毒載體的構建由上海吉凱生物科技有限公司完成，具體如下:兩個編碼人類sphk1(GenBank:NM_011451)的序列分別作為siRNA 靶序列和作為陰性對照的非定位導向序列。使用NCBI 數據庫篩選，以確保siRNA 靶序列只有sphk1 基因為目標序列。這些寡核苷酸退火形成雙鏈并通過T4 DNA 連接酶將pDC316 載體克隆至U6 啟動子的下游，并使用BamHⅠ和HindⅢ生成pDC316-sphk1 siRNA 載體。然后將pDC316-sphk1-siRNA 載體轉染至大腸桿菌感受態細胞DH5α 中，使轉染后的大腸桿菌感受態細胞DH5α 平鋪在含有20mg/ml 卡那霉素的LB-瓊脂板的表面。通過瓊脂糖凝膠電泳PCR 擴增以確定并挑取陽性克隆，然后通過使用3730 DNA 測序儀(ABI、CA、USA)對陽性菌落進行序列分析。轉染前24h，HEK 293 細胞被培養在密度為1.5×106個/60mm2的培養板上。根據Lipofectamine2000 的使用說明，將重組腺病毒質粒和其它輔助質粒共轉染到HEK 293 細胞。10～15d 后，細胞病變效應(CPE)逐漸明顯，貼壁細胞變得圓潤和消融。收集上清液及細胞并在37℃/～70℃反復凍融3 次。含有病毒載體的上清液于4℃以7000 轉/min 離心5min 后，使用byAdeno-XTM 純化試劑盒進行純化，然后保存在－70℃備用。斑點法檢測重組病毒的滴度［9］。

1.2 實驗動物 根據實驗動物管理標準的指導，11 個月年齡的APPsw/PS1(APP/PS1)雙轉基因小鼠(由南京大學模式動物研究所提供)(n=12)和野生型小鼠組(n=6)飼養在華中科技大學同濟醫學院動物房。在用12h 光照和12 個黑暗循環的恒溫環境中，每籠3 只。動物根據自身需要自由采食食物和水。其中注射sphk1-siRNA 者為siRNA 組，注射生理鹽水者為生理鹽水組，同型野生型小鼠為陰性對照組(n=6)。

1.3 立體定位注射法 APP/PS1 雙轉基因小鼠及同型野生型小鼠經10%水合氯醛0.6ml/kg 麻醉后，固定于攜帶0.5μl 漢密爾頓微量注射器的腦立體定位儀上。頭頂部去毛，消毒皮膚，沿正中切口，經雙氧水消毒后，充分暴露前囟。根據小鼠腦立位圖譜，于前囟后1.9mm、中-外左右各1.4mm、背-腹上下1.5mm 處，向雙側海馬緩慢注入1.5μl/位點(1×1011PFU/ml)的sphk1-siRNA 載體、生理鹽水及rAd-GFP，每側注射時間5min。后將針頭留在原先的位置60s 使溶液遠離針尖并充分擴散，緩慢退針。皮膚切開處用青霉素抗菌，縫合傷口。待小鼠蘇醒后送回動物房飼養，密切觀察小鼠的變化。

1.4 Western-blot 法 取出海馬后，稱量剪碎。加入400μl 單去污劑裂解液(含PMSF)，充分勻漿。4℃下12000rpm 離心5min。BCA 計算出蛋白濃度，配制10%的分離膠10ml 及4%的濃縮膠5ml，4℃電壓12V 轉膜過夜;再加入5μl 一抗，室溫下在搖床上緩慢搖動1h，再加入PVDF 膜與辣根過氧化物酶抗小鼠二抗(1∶5000)37℃孵育1h;5%脫脂奶粉(含0.05%Tween 20)洗3 次。ECL 化學發光法:在暗室中，按照1∶1 的比例等量混合ECL 化學發光試劑盒中的A、B 兩液，混勻后立即滴加于PVDF 膜表面(注意:濾膜的蛋白面應朝上)，室溫下孵育1～2min，然后用濾紙吸干濾膜表面多余的液體，將濾膜夾入透明塑料袋中，EPSON 彩色圖像掃描儀掃描成圖像文件并用Kodak Digital Science ID2.0 分析軟件分析條帶的灰度值，計算同一份標本的PAR-1 和PAR-2 蛋白與actin 蛋白灰度值的比值以對蛋白表達進行半定量分析。

1.5 免疫熒光法顯微鏡觀察 腹腔灌注4%的多聚甲醛及生理鹽水后分離腦組織，并將其在4%多聚甲醛中固定，待腦沉底后用冰凍切片機切片，厚度為10～12μm，膠水固定在載玻片上。后將玻片浸入4%多聚甲醛中固定10min，再用0.01 PBS漂洗5min×3 次。然后0.2% Triton X100(20%Triton X100+0.01PBS 100ml)室溫孵育30min，以增加細胞的通透性，PBS 清洗5min×3。并用5%胎牛血清(BSA)的0.01mol/L PBS 封閉20min，室溫孵育20min。倒掉封閉液，加入一抗 sphk1(羊抗，1∶150)，放入濕盒，37℃孵育，1h 后轉入4℃過夜，PBS 漂洗5min×3 次后加入羅丹明標記的二抗(兔抗，1∶100)，37℃，1h。然后再次加入一抗Abeta(兔抗，1∶200)，37℃孵育，1h 后轉入4℃過夜，0.01PBS 漂洗5min×3 次并加入Dylight 405 藍色熒光二抗(羊抗，1∶100)，37℃，2h。PBS 漂洗5min×3次后，使用碳酸甘油緩沖液封片，并用激光共聚焦顯微鏡觀察(Olympus、Tokyo、Japan)進行觀察。

1.6 電鏡超微結構觀察 將實驗動物經10%水合氯醛6ml/kg 腹腔麻醉后，按常規經左心室升主動脈灌注固定;然后開顱取腦，剝離海馬。置入4℃的2.5%電鏡專用戊二醛溶液中固定2h;后使用0.1 mol PBS 漂洗2 次，10min/次;再用1%四氧化鋨后固定2h;后丙酮梯度脫水，浸透、包埋、固化;并采用半薄切片定位及超薄切片，鈾染，鉛染，最后行電鏡(Hitachi H-7500)觀察。

1.7 統計學處理 使用SPSS 13.0 軟件(SPSS Inc，USA)進行統計分析，所有數據用均值±標準差(±s)表示。平均值的比較采用t 檢驗，P＜0.05其差異有統計學意義。

2 結果

2.1 sphk1-siRNA 對APP/PS1 雙轉基因AD模型鼠海馬超微結構的影響 轉染后1 個月，我們對siRNA 組、生理鹽水組、陰性對照組小鼠海馬組織行電鏡檢查。結果如圖1 所示:圖A 相對于圖C來說核質變空和部分神經元胞質變空，但線粒體和內質網整齊。圖B 相對于圖C 來說可見微絲和微管消失，細胞核核質減少，內質網凌亂，神經元不飽滿。由此可見成功轉染sphk1-siRNA 后，海馬超微結構變性程度加重(見圖1)。

2.2 sphk1-siRNA 對APP/PS1 雙轉基因AD模型鼠海馬DG 區新生神經元的影響 為了進一步檢測sphk1-siRNA 轉染后對小鼠DG 區新生神經元的影響，我們采用激光共聚焦的方法對其進行檢測。結果顯示:陰性對照組小鼠DG 區可見新生神經元形成，但是生理鹽水組及siRNA 組未見明顯新生神經元形成。由此可見siRNA 組及生理鹽水組小鼠突觸神經元再生功能受到抑制(見圖2)。

2.3 sphk1-siRNA 對APP/PS1 雙轉基因AD模型鼠海馬組織s1P 受體的影響 由于s1p 通過G蛋白偶聯發揮其生物學作用且影響突觸后遞質的傳遞，所以我們采用real-time PCR 對小鼠是s1p 受體(s1pr)進行了檢測，結果發現siRNA 組s1pr1 表達明顯低于其他兩組，而s1pr3 表達則明顯高于其他兩組。

2.4 sphk1-siRNA 對APP/PS1 雙轉基因AD模型鼠突觸后膜蛋白SNAP-25 表達的影響 為了進一步證實sphk1 表達下降后對突觸后神經元的影響，我們采用Western-blot 的方法對APP/PS1 突觸后膜蛋白SNAP-25 進行了檢測，結果顯示siRNA 組SNAP-25 表達明顯低于其他兩組。

3 討論

阿爾茨海默病是一種最常見的漸進性大腦退行性病變，其發病率隨年齡增長逐漸增高。臨床上主要表現為進行性認知功能障礙。而其主要的神經病理學以β 淀粉樣蛋白(amyloid beta-protein，Aβ)沉積為核心的老年斑、神經元內的神經原纖維纏結和明顯的膠質化為特征。迄今其確切的病因和發病機制尚未充分闡明，尚無有效的根治良策。

神經鞘脂(sphingolipid)代謝物包括神經鞘磷脂、神經酰胺、鞘氨醇和1-磷酸鞘氨醇等多種代謝產物，目前研究發現這些磷脂的代謝產物參與細胞增殖與凋亡的調控。Cer 和Sph 是細胞增殖的負調控子，能夠抑制細胞生長、促進細胞凋亡;而其下游的代謝物s1p 則刺激細胞生長、抑制細胞凋亡［10］。S1p 既是細胞內信號轉導的信使分子，又可以分泌至細胞外并通過細胞表面的s1p 受體發揮生物學效應。細胞內Cer、Sph 和s1p 的水平通過酶促反應維持動態平衡，從而維持細胞的生理功能并決定細胞的生存和凋亡，因此，有人將由Cer、Sph 和s1p 共同構成的動態體系形象地稱作“鞘磷脂變阻器”(sphingolipic rheostat)［5］。鞘氨醇激酶是“鞘磷脂變阻器”的關鍵調節子。sphk1 將Sph 轉化成s1p，不僅能夠增加促生長、抗凋亡的信號分子s1p 水平，而且能夠減少促凋亡的Cer 和Sph 的水平。因此sphk1 是維持細胞內上述物質平衡的重要限速酶，也是細胞增殖及存活的重要調控因子［10］。

突觸功能障礙常發生在AD 病理改變的早期且為具有標志性的改變。Aβ 沉積導致網絡活動異常興奮和涉及學習和記憶通路代償性的抑制反應，這些改變都會促進認知能力下降［11］。研究發現s1p參與少突膠質細胞［12］、中樞神經系統髓鞘細胞［5］的生長和存活以及調節神經元的興奮性［13］。海馬神經元中的s1p 通過s1p 受體來促進神經遞質的釋放［14］，且與s1p 受體偶聯的G 蛋白與激活下游信號通路不同效應的分子具有不同的親和力［15］。S1pr1可以調節神經軸突的形成/延伸，s1pr3 則剛好起著相反的作用［16］。例如，sphk1 的激活和s1p 的形成可以保護中腦神經元免受谷氨酸誘導的神經毒性的影響［17］。多巴胺誘導的谷氨酸鹽的釋放依賴于sphk1 的激活及s1p 的形成以及相應的s1p 受體的產生，表明s1p 通過其自分泌的作用促進海馬神經元中谷氨酸的分泌［15］。

綜上所述，s1p 的形成可以通過上調s1p 和它的受體的表達提高突觸的活性。我們的研究表明，sphk1-siRNA 轉染后神經酰胺減少的同時促進s1p 的產生具有重要意義。同時，Aβ 寡聚體病理性的沉積抑制了突觸興奮性的傳遞，但也引發了神經回路和網絡異常的癇樣放電模式［18］。SNAP-25 作為突觸后膜SNARE 復合體組成之一，在sphk1-siRNA 轉染后表達明顯減少，從另一方面說明了突觸活性下以及學習和記憶能力顯著惡化的原因。

由此可見，sphk1-siRNA 轉染后抑制了APP/PS1雙轉基因小鼠海馬DG 區神經元的再生及突觸的功能，這進一步豐富并完善了之前的研究，揭示了sphk1基因沉默后APP/PS1 雙轉基因小鼠行為學障礙加重的原因，同時也為進一步探索sphk1 高表達逆轉阿爾茨海默病雙轉基因模型鼠病理改變提出了新的可能。

圖1 轉染Sphk1-siRNA 后海馬超微結構的改變

圖2 轉染Sphk1-siRNA 后海馬DG 區神經元的改變

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