EPO 干預后大鼠腦缺血再灌注區域STAT1 和STAT3 蛋白表達與細胞凋亡

姜春娟，許 倩，徐 凱，代海洋，吳文娟，張追陽

缺血性腦血管病以其高發病率、高死亡率、高致殘率嚴重危害人類身心健康。腦缺血再灌注損傷是缺血性腦血管病重要的病理生理過程。我們探討信號轉導與轉錄激活子(signal transducer and activator of transcription，STAT)在這一過程中的作用。STATs參與細胞生長、轉化、凋亡等生理功能的調節［1］。STATs 在腦缺血再灌注過程中被激活，以其磷酸化的形式(phosphorylated STAT，P-STAT)發揮相應的生物學作用［2］。STATs 家族包括7 種轉錄因子，但不同的STATs 在腦缺血再灌注損傷中起到不同的作用，腦缺血再灌注損傷可以激活STAT1、STAT3。STAT1 與腦缺血再灌注后神經細胞死亡有關，其作用機制包括誘導神經細胞凋亡和激活其他細胞死亡基因等。STAT3 通過營養因子和細胞因子與腦缺血再灌注后神經保護作用相關［3］。

研究表明，EPO 對神經細胞具有營養和抗凋亡的雙重作用［4］。EPO 的神經保護作用已經在動物腦缺血模型、機械性損傷、刺激性毒性損傷、神經炎和1，2，3，6-tetrahydropyridine 誘導的老鼠的帕金森病中所證實［5］。而Kretz 等［6］發現EPO 發揮腦保護作用的靶點為STAT3。我們建立大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷模型，觀察EPO 對腦缺血再灌注損傷區STAT1、STAT3 及其磷酸化水平的表達與腦梗死體積及細胞凋亡的影響。

1 材料和方法

1.1 研究對象 雄性Sprague Dawley(SD)大鼠120 只，體重300～330g，由江蘇省徐州醫學院動物中心提供。動物完全隨機分為4 組，分別為A 假手術組、B 單純腦缺血再灌注組、C 腦缺血再灌注+生理鹽水組和D 腦缺血再灌注+EPO 組，每組30只動物，B、C、D 組均缺血2h 和再灌注24h。

1.2 主要試劑 TTC 染色試劑盒購自Biosharp 公司，Western blot 檢測試劑盒購自美國Upstate Biotechnology，Inc，免疫組織化學STAT1 抗體及磷酸化STAT1 抗體購自Bioworld Technology 公司，STAT3 抗體及磷酸化STAT3 抗體購自Cell Signalling 公司，原位細胞凋亡檢測試劑盒(TUNEL)購自美國羅氏公司，重組人促紅細胞生成素注射液購自沈陽三生制藥有限公司。

1.3 動物模型制備 采用改良的Longa 法［7］將SD 大鼠制成一側大腦中動脈阻斷(MCAO)模型。用10%水合氯醛(30mg/kg)麻醉大鼠，頸部正中切口，手術顯微鏡下分離左側頸總動脈、頸內動脈和頸外動脈，動脈夾夾閉頸內動脈，在距頸總動脈0.8～1.0cm 處結扎頸外動脈，將處理過的線栓從小口分叉處輕輕推入頸內動脈，當線插入距頸總動脈分叉17.5～18.5mm 處并有輕微阻力時，表示線已經插入Willie’s 環大腦中動脈起始部，阻塞了大腦中動脈主干的血流，活結結扎頸內動脈內的線栓。術后切口縫合包扎，大鼠放回籠內給予食物及水源，用燈泡保持大鼠體溫在37℃左右。2h 時拔線，再灌注24h 時進行后處理。假手術組將線栓插入5mm，其余步驟同腦缺血再灌注組。D 組于腦缺血剛開始時腹腔注射EPO(5000IU/kg)，C 組腹腔注射等量0.9%生理鹽水。

1.4 TTC 染色 各組動物缺血2h 再灌注24h后立即斷頭取腦，于－20℃冰箱中速凍20min，冠狀位切成2mm 厚的切片，置于2% 的TTC 溶液中，37℃避光染色30min，每隔5min 翻動腦片使均勻接觸到染色液，4%多聚甲醛固定24h。染色后，正常腦組織呈鮮紅色，梗死腦組織呈白色。數碼相機拍照后輸入計算機，用病理圖像分析系統計算測量TTC 失染區體積。為了降低因腦水腫所產生的誤差，通過以下公式進行校正，梗死體積=對側半球體積－梗死側正常腦組織體積。

1.5 Western blot 分析 大鼠斷頭取腦，迅速分離缺血區腦組織，抽提并測量蛋白，等量蛋白樣品經10%SDS-聚丙烯凝膠電泳分離后，以濕轉法電轉移至NC 膜上，用新鮮配制的含3%脫脂奶粉的PBS液封閉，將STAT1 兔多克隆抗體(1∶500)、P-STAT1兔多克隆抗體(1∶500)、STAT3 兔多克隆抗體(1∶1000)、P-STAT3 兔多克隆抗體(1∶1000)及βactin 抗體(1∶1000)稀釋在新鮮配制的含3%脫脂奶粉的PBS 液中，4℃過夜后，加入相應的二抗。以NBT-BCIP 顯色，結果以Image J 圖像分析軟件分析條帶，測相對灰度值(rOD)，計算公式為相對灰度值(rOD)=缺血的ROI 的OD 值/假手術組OD 值。

1.6 免疫組織化學染色(SP 法)石蠟切片常規脫蠟至水，在檸檬酸鹽緩沖液(pH6.0)中微波修復10～15min，自然冷卻至室溫，PBS 洗3 次，3%過氧化氫37℃孵育10min 以阻斷內源性過氧化物酶活性，PBS 沖洗3 次，滴加正常山羊血清封閉抗原25min，加入STAT3 抗體(1∶100)、P-STAT3 抗體(1∶50)，4℃孵育過夜，PBS 沖洗3 次，滴加生物素標記羊抗兔37℃孵育25min，滴加辣根酶標記鏈霉卵白素工作液，DAB 顯色，蘇木精復染、脫水、透明、封片。陰性對照用0.01mol/L PBS 代替一抗。光鏡下觀察，以胞漿或胞核染成棕色的細胞為陽性細胞。

1.7 細胞凋亡檢測 采用TUNEL 原位細胞凋亡檢測試劑盒，大鼠腦組織固定后，用proteinase K工作液處理組織，加入TUNEl 反應混合物暗濕盒中37℃反應1h，然后加入POD 37℃暗濕盒中反應30min，最后加入DAB 顯色及在蘇木素中復染。取4 張切片，每張切片隨機選取5 個視野(×400)，計算每mm2內凋亡陽性細胞的核數。

1.8 統計學處理方法 應用SPSS 16.0 統計學軟件，各組實驗結果以均數±標準差(±s)表示。將所有數據進行正態性和方差齊性檢驗，組間比較采用單因素方差分析(One-way ANOVA)，多個實驗組之間比較采用SNK 法，采用雙側檢驗作為判定標準，以P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 TTC 染色顯示腦缺血再灌注后腦梗死體積變化情況 A 組可見到兩側大腦半球呈均勻一致紅染;B、C、D 組于左側大腦半球左側大腦中動脈供血區可見大小不等梗死灶。B 組及C 組于左側大腦半球皮質及紋狀體均可見大片狀腦缺血失染區呈白色，其梗死體積分別為287±22mm3、291±27mm3。D組左側大腦半球僅皮質處可見斑片狀失染區，其梗死體積為151±24mm3，與B、C 組相比，EPO 組腦梗死體積明顯縮小(P＜0.05)，B 組和C 組比較失染區體積差異無統計學意義(P＞0.05)(見表1)。

2.2 EPO 干預后腦缺血再灌注損傷區域STAT1、P-STAT1、STAT3、P-STAT3 表達情況 Western blot 結果顯示STAT1 蛋白表達在4 組中的rOD值分別為2.07±0.18、1.99±0.12、2.00±0.20、1.94±0.23，組間比較結果顯示4 組間差異無統計學意義(F=0.806，P＞0.05);同樣，STAT3 蛋白表達在4 組中的rOD 值分別為:1.99±0.14、2.03±0.13、2.05±0.14、1.92±0.11，組間比較差異無統計學意義(F=1.558，P＞0.05)，這表明STAT1、STAT3 蛋白在正常腦組織中表達，且缺血2h 再灌注24h 及EPO 干預后對二者表達水平均無顯著影響。而P-STAT1、P-STAT3 在正常腦組織中表達較低，腦缺血再灌注后P-STAT1、P-STAT3 蛋白表達增加，EPO 干預后，與B、C 組比較，D 組的P-STAT3 表達明顯增加(F=40.719，P＜0.05)，P-STAT1 表達有所減少(F=3.274，P＞0.05)，B 組與C 組之間無顯著差異(P＞0.05)(見表1)。

表1 大鼠腦缺血再灌注后腦梗死體積、STAT1、P-STAT1、STAT3、P-STAT3表達rOD 值及凋亡細胞數(n=30，±s)

表1 大鼠腦缺血再灌注后腦梗死體積、STAT1、P-STAT1、STAT3、P-STAT3表達rOD 值及凋亡細胞數(n=30，±s)

與B 組比較* P＜0.05;與C 組比較#P＜0.05

免疫組織化學染色結果顯示STAT1、STAT3 蛋白在正常腦組織中表達，陽性細胞表現為細胞呈棕褐色著色，缺血再灌注及EPO 干預的STAT1、STAT3蛋白表達水平均無明顯變化。在正常腦組織中可見少量P-STAT1、P-STAT3 免疫陽性細胞，腦缺血再灌注后P-STAT1、P-STAT3 蛋白表達增加，EPO 干預后，與B、C 組比較，D 組的P-STAT3 陽性表達明顯增加，P-STAT1 表達有所減少。總體而言，免疫組織化學染色結果與Western blot 結果呈一致性。

2.3 EPO 對大鼠腦缺血再灌注損傷區域細胞凋亡的影響 假手術組見個別散在凋亡細胞，凋亡細胞數為30±18/mm3，腦缺血再灌注組及生理鹽水組可見大量凋亡細胞，表現為細胞核呈棕色或棕褐色著染，核形呈碎點狀，不規則，大小不一，凋亡細胞數分別為423±23/mm3、412±35/mm3。EPO 組凋亡細胞數量明顯減少，其凋亡細胞數為239±29/mm3，經統計學處理D 組與B、C 組之間差異有統計學意義(P＜0.05)，B 組與C 組之間無顯著差異(P＞0.05)(見表1)。

3 討論

STATs 蛋白的表達在神經元的存活中起到重要作用，腦缺血再灌注后可以激活STAT1、STAT3，但同時觀察EPO 干預后腦缺血再灌注損傷區域STAT1、STAT3、P-STAT1、P-STAT3 4 種蛋白表達情況國內外未見報道。本實驗建立腦缺血再灌注損傷動物模型，研究該損傷區域JAK/STAT 信號轉導通路中STATs 蛋白表達與腦梗死體積及細胞凋亡數目的變化。

腦缺血造成的神經元死亡(neuronal death)可分為壞死(necrosis)和凋亡(apoptosis)兩種。大量實驗報道，神經元壞死主要發生于缺血嚴重的核心區，而凋亡則多發生于缺血的周邊區和腦內某些缺血易感部位。神經元缺血性壞死難于逆轉，然而凋亡可通過對其上游信號的調節進行干預，腦缺血治療策略正是以這些壞死邊緣的凋亡細胞為目標進行的［8，9］。研究表明，STAT1 通過轉錄依賴性及非依賴性途徑在促進細胞凋亡過程中有重要的作用［10］。而STAT3 的激活可以通過抗細胞凋亡發揮腦保護作用。

3.1 EPO 干預后腦缺血再灌注區域STAT1、PSTAT1、STAT3 及P-STAT3 變化 本研究利用Western blot 和免疫組織化學染色檢測方法，結果顯示STAT1、STAT3 蛋白在正常腦組織中表達，而PSTAT1、P-STAT3 在正常腦組織中蛋白表達和免疫反應陽性細胞均較低，說明在正常生理狀態下腦組織中STAT1、STAT3 是以無活性的非磷酸化形式存在的。腦缺血再灌注損傷后P-STAT1、P-STAT3 蛋白表達增加，說明腦缺血再灌注時STAT1、STAT3 被激活。本實驗Western blot 和免疫組織化學染色結果顯示EPO 干預后，P-STAT3 蛋白表達和免疫反應陽性細胞進一步明顯增加，而P-STAT1 表達有所減少，說明EPO 可促進JAK/STAT 信號轉導通路中STAT3的磷酸化和活化。Kretz 等［6］發現EPO 發揮腦保護作用的靶點為STAT3，本實驗結果顯示EPO 干預后P-STAT1 表達水平有所降低，結合之前研究及本實驗結果，提示應用EPO 后可促進P-STAT3 的活化，激活的P-STAT3 的表達增加在一定程度上可能降低了P-STAT1 的激活，說明STAT1 與STAT3 之間可能存在一定的相互作用機制。我們推測可能有兩方面原因，一方面可能與EPO 激活STAT3 有關，活化的STAT3 可能上調SOCS3 基因［11，12］，對STAT1 的表達起到了一定的抑制作用;另一方面，STAT1 與STAT3可能競爭相同的受體，活化的STAT3 能夠代替STAT1促使特定的IFN-γ 依賴性基因的轉錄，從而活化的STAT3 能夠對抗IFN-γ 介導STAT1 活化所引起的凋亡。

3.2 EPO 干預后腦缺血再灌注區域P-STAT1、P-STAT3 激活與腦梗死體積及細胞凋亡的關系 本實驗結果顯示EPO 干預后，TTC 染色所示大鼠腦梗死體積較未干預組明顯縮小，Western blot 及免疫組織化學染色顯示P-STAT3 表達明顯增加，P-STAT1表達水平有所降低，TUNEL 染色顯示凋亡細胞數目明顯減少，以上結果提示EPO 可促進JAK/STAT 信號轉導通路中STAT3 的磷酸化和活化，而P-STAT3的激活可挽救腦缺血再灌注損傷區域中細胞的凋亡，減少其凋亡的數量，從而促進損傷修復，縮小梗死區。同時也表明P-STAT1 表達的降低有助于阻止腦缺血再灌注損傷后神經功能缺損的惡化，減少細胞凋亡。以上研究結果與Li 等［13］發現在小鼠持續性局灶性腦缺血模型缺血前30min 和缺血后24h 腹腔注射大劑量EPO(5000IU/kg)可使腦梗死體積明顯縮小，和抑制神經細胞凋亡等結論相一致。

綜上所述，本研究經腹腔注射EPO 后，大鼠腦梗死體積明顯縮小，TUNEL 檢測結果證實腦缺血再灌注損傷區神經細胞凋亡數目明顯減少，其保護作用可能與EPO 干預后促進P-STAT3 表達的增加及一定程度上抑制P-STAT1 的表達有關。但對于EPO發揮腦保護作用的確切生物學作用機制尚有待進一步研究。

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