血管性癡呆模型大鼠NOS、NO 的表達

井 沆，肖 雁，官志忠

血管性癡呆(vascular dementia，VaD)是老年期癡呆的主要類型之一，是由一系列腦血管因素(腦組織梗死、低灌注或出血等)導致腦組織損害引起的以認知功能障礙為特征的綜合征［2］。關于血管性癡呆的眾多發(fā)病機制中鈣超載學說占主流地位，鈣超載后引起鈣信號通路的過度激活從而觸發(fā)了Ca2+依賴的級聯(lián)反應，導致神經(jīng)元的損傷甚至死亡［3］。一氧化氮合酶(Nitric oxide synthase，NOS)是此通路中的一個關鍵酶，NOS 是催化L-精氨酸產(chǎn)生NO 和L-胍氨酸的專一酶［4］，NOS 有2 種類型:誘導型NOS(inducible nitric oxide synthase，iNOS)和結(jié)構(gòu)型NOS(constitutive nitric oxide synthase，cNOS)，有研究表明iNOS 參與了VaD 引起的遲發(fā)性腦損傷［5］。本實驗首先觀察NOS 和NO 在VaD 模型大鼠和假手術大鼠血清及海馬中的表達，然后對造模后1月組和造模后2 月組的NOS 和NO 結(jié)果進行分析，探討NOS 和NO 在造模不同時間段的表達差異，探討其在VaD 發(fā)病進程中的作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 成年健康SD 大鼠60 只(購自重慶第三軍醫(yī)大)，體重200～250g，雌雄各半，隨機分為模型組和假手術組。

1.1.2 試劑 NOS、NO 試劑盒由南京建成生物工程公司提供。鼠抗β-actin 單克隆抗體、鼠抗NOS 單克隆抗體、HRP 標記的抗鼠二抗購自美國Santa Cruz 公司。5×蛋白上樣緩沖液，RIPA 裂解液，SDS-PAGE 凝膠配制試劑盒均購于碧云天生物試劑公司。聚乙烯二氟(PVDF)膜、ECL-Plus 發(fā)光試劑、高效顯影膠片購于Amersham 公司。顯影液、定影液購于柯達公司。BCA 法蛋白定量測試盒購于上海捷瑞生物工程有限公司。

1.2 方法

1.2.1 動物篩選及分組 60 只SD 大鼠，雌雄各半。適應性喂養(yǎng)1w 后，進行Morris 水迷宮定向航行實驗和空間探索實驗［6］，第1～4 天進行定向航行試驗:每日將大鼠按Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ象限順序從各入水點靠池壁放入水中，記錄60s 內(nèi)大鼠從入水到爬上平臺(固定于第象限)所需時間即逃避潛伏期。每只大鼠每天訓練4 次。第5 天撤去平臺，進行空間探索實驗:記錄大鼠2min 內(nèi)穿過原站臺位置的次數(shù)。選取學習、記憶力相近的大鼠隨機分為假手術組與VaD模型組，模型組再分1 月組及2 月組，每組15 只。

1.2.2 大鼠VaD 模型的制備［7］大鼠術前12h 禁食，4h 禁水。大鼠稱重后用10% 水合氯醛(0.3ml/100g)腹腔注射，麻醉成功后俯臥位固定、備皮、碘伏和75%乙醇消毒，行背側(cè)頸正中切口，暴露雙側(cè)第一頸椎橫突翼小孔，用直徑0.5mm 電凝針插入雙側(cè)翼小孔凝閉雙側(cè)椎動脈，逐層整理好皮下組織，局部傷口縫合前涂以適量青霉素粉以防止感染，間斷縫合皮膚。24h 后行頸前正中切口，分離各層組織暴露雙側(cè)頸動脈后穿線待用，拉起穿線用微動脈夾夾閉雙側(cè)頸總動脈5min，共夾閉3 次，每次間隔1h。假手術組只分離椎動脈和頸總動脈，不進椎動脈凝閉和夾閉。1 月后大鼠死亡12 只，存活18 只，其中假手術組10 只，模型組8 只。2 月后大鼠死亡15 只，存活15 只，其中假手術組9 只，模型組6 只。

1.2.3 學習記憶能力測定 分別于造模后1月、2 月，用Morris 水迷宮檢測模型大鼠的學習記憶能力，方法同1.2.1。

1.2.4 組織樣本的制備 水迷宮測試結(jié)束后進行取材。將大鼠脫頸處死，冰盤上快速剖取全腦，棄去嗅球及小腦，取海馬組織，用冰生理鹽水沖洗血液，再用濾紙拭干，電子天平稱重后迅速投入1.5ml的EPP 管中，加入9 倍冷生理鹽水，在玻璃勻漿器中研磨成10% 勻漿，低溫高速離心機上4℃、12000r/min 離心5min，提取上清液，－80℃凍存待檢。以10%水合氯醛(0.3ml/100g)腹腔注射麻醉后，立即股動脈取2ml 血液于肝素抗凝管中，再將抗凝管中血液迅速離心分離出血漿，－80℃凍存待檢。

1.2.5 tNOS、iNOS 活性和一氧化氮(NO)含量的測定 取出血漿，用NOS 和NO 測定試劑盒對其進行測定。于550nm 測定NO 含量;530nm 波長下測定吸光度，根據(jù)吸光度大小可計算NOS 活力。根據(jù)cNOS 依賴鈣而iNOS 不依賴鈣進行分型。具體步驟參照試劑盒說明操作。

1.2.6 海馬NOS 蛋白水平 取海馬組織，加入冰預冷的RIPA 裂解液(PMSF 和裂解液比例為1∶100)用電動勻漿器于冰上制成10%的腦組織勻漿。并置于冰上1h［8］，使腦組織細胞充分溶解。12000r/min 4℃離心25min，小心吸取上清液至1.5 ml 的EPP 管中，BCA 法蛋白定量測試盒對上清液進行蛋白定量，操作按照蛋白定量試劑盒說明書進行。取10%海馬組織勻漿進行Western blotting 檢測NOS 和β-actin 蛋白表達。

1.2.7 結(jié)果分析 Western blotting 結(jié)果用GDS-8000 型UVP 凝膠成像系統(tǒng)照相，以Labworks軟件分析結(jié)果，以β-actin 蛋白條帶作為內(nèi)參照，以NOS 蛋白條帶與β-actin 蛋白條帶像素灰度的百分比值作為NOS 蛋白質(zhì)表達的相對水平。

1.2.8 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 13.0 統(tǒng)計分析軟件，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差(±s)表示，組間比較采用單因素方差分析或非參數(shù)檢驗，P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 行為學結(jié)果 模型1 月組大鼠平均逃避潛伏期明顯長于對照組(P＜0.05)，表明VaD 大鼠定向航行能力降低，第5 天，觀察空間探索時移走平臺，以在原平臺象限(第1 象限)的活動時間為指標，與對照組比較，模型組第1 次穿越平臺所用時間延長(P＜0.05)，穿越站臺次數(shù)明顯減少(P＜0.05)。表明VaD 大鼠學習能力降低。1 月組和2月組之間無統(tǒng)計差異(P＞0.05)(見表1)。

2.2 血漿NO 和海馬組織NO 表達含量 與假手術相比較，1 月和2 月模型組大鼠血漿和海馬組織中的NO 含量明顯增高(P＜0.05)，差異有統(tǒng)計學意義，與模型組中NOS 活性高于假手術組的結(jié)果相符。對比1 月組和2 月組NO 情況可見，1 月組NO 的含量明顯多于2 月組，差異明顯(P＜0.05)，有統(tǒng)計學意義(見表2)。

2.3 血漿和海馬組織tNOS 和iNOS 酶活性對1 月組和2 月組進行血漿及海馬組織tNOS 和iNOS 酶活性的測定發(fā)現(xiàn)，與假手術組相比較，模型組大鼠血漿和海馬組織中tNOS 和iNOS 酶活性明顯增高，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。1 月模型組和假手術組血漿及海馬組織tNOS 和iNOS 活性和2 月組分別進行對比，顯示1 月組tNOS 和iNOS 活性高于2 月組，差異明顯(P＜0.01)，有統(tǒng)計學意義(見表3)。

2.4 模型組和對照組海馬NOS 蛋白表達水平與對照組相比較 模型組海馬組織NOS 蛋白表達水平明顯偏高(P＜0.05)差異有統(tǒng)計學意義。1 月組海馬NOS 蛋白表達高于2 月組(P＜0.05)(見圖1)。

表1 VAD 組及假手術組大鼠定向航行實驗及空間探索實驗結(jié)果的比較(±s)

表1 VAD 組及假手術組大鼠定向航行實驗及空間探索實驗結(jié)果的比較(±s)

與假手術組比較* P＜0.05

表2 血漿和海馬組織NO 表達情況(血漿NO 單位:μmol/L;海馬組織NO 單位:μmol/g prot)

表3 1 月組和2 月組血漿及海馬組織tNOS 和iNOS 酶活性(血漿 單位:U/ml;海馬單位:U/mg prot)

圖1 NOS 蛋白表達水平

3 討論

VaD 是老年癡呆最常見病因之一，而關于VaD的發(fā)病機制有多種學說。鈣超載被認為是VaD 發(fā)病機制中的一個重要致病因素，但是鈣超載在VaD 記憶和認知功能低下中的機制尚未闡明。近年來，一氧化氮在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的病理生理作用成為神經(jīng)科學的研究熱點之一，有研究發(fā)現(xiàn)一氧化氮可參與突觸可塑性、神經(jīng)元興奮毒性及炎癥損害等多種過程，且與學習和記憶密切相關。VaD 發(fā)病時興奮性氨基酸釋放增多，激活N-甲基-D-天門冬氨酸(NMDA)受體，使海馬神經(jīng)元細胞內(nèi)Ca2+濃度超載，NOS被大量激活并產(chǎn)生過量NO，過量的NO 不僅參與了腦損害，且在癡呆發(fā)病機制中可能有重要的作用［9］。

NO 性質(zhì)活潑，半衰期極短，在體內(nèi)生物半衰期僅數(shù)秒鐘，是一種正常生理狀態(tài)下存在的信息分子，在維持神經(jīng)元功能等方面有著重要作用。最近研究更表明，NO 在神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)既有潛在的腦保護作用又有神經(jīng)毒性的危害作用，猶如一把雙刃劍［10］。NO的作用與NOS 水平密切相關［11］，對NOS 蛋白表達變化的研究是對NO 進行深入探討的重要環(huán)節(jié)。NOS 主要有2 種類型，結(jié)構(gòu)型(cNOS)和誘導型(iNOS)，它們執(zhí)行不同的生理和病理功能，cNOS 是生理存在形式，依賴Ca2+或鈣調(diào)蛋白，作用快速短暫，生成NO 少;iNO 在腦缺血狀態(tài)下過度表達，作用時間長，NO 生成量多［12］。腦缺血發(fā)生后，NOS 短暫急劇升高，此時的NOS 主要來源于cNOS。cNOS 平時以非活性形式存在，并受Ca2+/CaM 調(diào)節(jié)，cNOS 的大量激活引起NO 的升高。但隨著缺血時間的延長，腦組織中O2和L-精氨酸供給減少，NOS 活性會逐漸下降。而由iNOS 介導引起的神經(jīng)毒性作用，主要參與VaD 引起的缺血晚期腦損傷。隨著時間的延長，可使iNOS 激活，而iNOS 一旦生成就會持續(xù)產(chǎn)生NO而不受胞內(nèi)Ca2+濃度的影響，過量的iNOS 產(chǎn)生大量具有神經(jīng)毒性作用的NO，在海馬遲發(fā)型神經(jīng)元凋亡和癡呆形成中均發(fā)揮了一定的作用。NO 作為細胞內(nèi)信使參與長時程增強(LTP)的誘導和形成，NOS與NO 可影響學習記憶等過程，iNOS 被認為是影響學習記憶的關鍵酶［13］。

本研究不僅對血管性癡呆大鼠血漿及腦組織內(nèi)NOS 活性和一氧化氮進行了研究，還對比分析了癡呆大鼠缺血后1 月和2 月血漿和海馬組織內(nèi)NOS、NO 的活性含量，探索了NOS 以及NO 在癡呆發(fā)病中的一個動態(tài)變化情況。結(jié)果顯示，經(jīng)4-VO 造模后，血管性癡呆模型大鼠平均逃避潛伏期明顯長于假手術組，撤去平臺后，模型組第1 次穿越平臺所用時間延長，穿越站臺次數(shù)明顯減少，表明VaD 大鼠模型構(gòu)建良好，但是1 月組和2 月組之間的差異無統(tǒng)計學意義。模型1 月組和2 月組血漿和海馬組織NOS 酶活性及NO 含量顯著高于假手術組，并且與行為學上的變化相一致。大鼠缺血2 月后血漿和海馬組織iNOS 的活性仍然比較高，推測隨著缺血時間的延長，NOS 主要來源于iNOS。iNOS 活性持續(xù)時間較長，可引起長時間的NO 的晚期釋放。通過對比1 月組和2 月組血漿和海馬組織NOS 和NO 含量發(fā)現(xiàn)，1月組血漿和海馬組織NOS 活性和NO 含量均高于2月組，表現(xiàn)為隨著病程的延長，2 月組的NOS 活性和NO 含量趨于下降，這一方面可能與前期釋放的cNOS 活性的下降導致tNOS 的總活性減弱有關，另外也可能與自身缺血疾病的緩慢緩解和改善有關。

綜上所述，NOS 活性和NO 含量可能與腦缺血后引起的神經(jīng)損傷密切相關，可能在血管性癡呆疾病形成過程中發(fā)揮了重要的作用。

［1］李文東，姜洪波，連曉清，等.Pulsinelli 四血管法大鼠全腦缺血模型制作方法的改進［J］.新鄉(xiāng)醫(yī)學院學報，2010，27(3):237－239.

［2］Benisty S.Current concepts in vascular dementia［J］.Geriatr Psychol Neuropsychiatr Vieil，2013，11(2):171－180.

［3］Szdnoki Z，Havasi V，Bene J，et al.Endothelial nitricoxide synthase gene in teractions and the risk of ischaemie stroke［J］.Acta Neurol Scand，2005:3(1):29－33

［4］Seyidova D，Aliyev A，Rzayev N，et al.The role of nitric oxide in the pathogenesis of brain lesions during the development of Alzheimer’s disease［J］.In Vivo，2004，18(3):325－333.

［5］Aliev G，Palacios HH，Lipsitt AE，et al.Nitric oxide as an initiator of brain lesions during the development of Alzheimer’s disease［J］.Neurotox Res，2009，16(3):293－305.

［6］況時祥，劉繼剛，肖 燕，等.腦通膠囊對血管性癡呆大鼠學習記憶能力及腦組織NO、SOD 含量的影響［J］.中國中醫(yī)急癥，2010，19(8):1368－1370.

［7］肖 雁，吳昌學，官志忠.血管性癡呆大鼠海馬神經(jīng)型膽堿能受體的變化［J］.臨床神經(jīng)病學雜志，2009，22(6):426－429.

［8］肖 雁，王曉亮，鄧 婕，等.腦通復方對大鼠海馬尼古丁受體的影響［J］.時珍國醫(yī)國藥，2010，21(6):1305－1307.

［9］Aliyev A，Seyidova D，Rzayev N，et al.Is nitric oxide a key target in the pathogenesis of brain lesions during the development of Alzheimer＇s disease［J］.Neurol Res，2004，26(5):547－553.

［10］Min D，Guo F，Zhu S，et al.The alterations of Ca2+/calmodulin/CaMKII/CaV1.2 signaling in experimental models of Alzheimer＇s disease and vascular dementia［J］.Neurosci Lett，2013，22(538):60－65.

［11］Van Oijen M，Witteman JC，Hofman A，et al.Fibrinogen is associated with an increased risk of Alzheimer disease and vascular dementia［J］.Stroke，2005，36(12):2637－2641.

［12］Salerno L，Sorrenti V，Di Giacomo C，et al.Progress in the development of selective nitric oxide synthase(NOS)inhibitors［J］.Curr Pharm Des，2002，8(3):177－200.

［13］Kullmann DM，Lamsa KP.LTP and LTD in cortical GABAergic interneurons:emerging rules and roles［J］.Neuropharmacology，2011，60(5):712－719.