乙醛刺激大鼠肝星狀細胞株HSC-T6增殖的體外研究

邢慧芳，李煥敏，王英杰，張旭慧，焦麗琴，李素婷

(1.承德醫學院臨床醫學專業2010級，河北承德 067000;2.指導教師)

學生園地

乙醛刺激大鼠肝星狀細胞株HSC-T6增殖的體外研究

邢慧芳1，李煥敏1，王英杰1，張旭慧1，焦麗琴1，李素婷2

(1.承德醫學院臨床醫學專業2010級，河北承德 067000;2.指導教師)

乙醛;肝星狀細胞;增殖;模型

肝星狀細胞(hepatic stellate cell,HSC)的活化增殖與酒精性肝纖維化的形成密切相關，是酒精性肝損傷發展至肝纖維化的中心環節[1]。乙醇的代謝產物乙醛是刺激HSC活化增殖，導致酒精性肝纖維化發生的關鍵因子[2]。本研究以乙醛作為刺激物，觀察乙醛刺激大鼠肝星狀細胞增殖的最佳濃度和最佳時間，為后期酒精性肝纖維化的的相關研究提供實驗數據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器 肝星狀細胞株HSC-T6，凱基生物有限公司;DMEM高糖培養基，GIBCO公司;胎牛血清，Hyclone公司;MTT，Sigma公司;DMSO，上海生工。CO2培養箱，日本Taibai LNA-122D;倒置顯微鏡，德國Olympus;酶標儀，日本BIO-RAD;離心機，上海TGL.16G。

1.2 方法

1.2.1 大鼠肝星狀細胞培養:大鼠肝星狀細胞株HSC-T6，以含10%胎牛血清的DMEM培養基，置于37℃、5%CO2混合氣體的CO2培養箱中培養，細胞換液時間為1-2d，傳代時間為2-3d，傳代前用0.25%的胰酶消化。

1.2.2 細胞分組:細胞傳代穩定后，HSC隨機分為空白對照組和乙醛不同濃度刺激組，每組設3個復孔。乙醛刺激組給予乙醛刺激，空白對照組常規培養。

1.2.3 MTT法檢測不同濃度乙醛對HSC增殖的影響:調整細胞計數為1×105后，均勻接種于96孔培養板中培養，每孔總體積為200μl，各組細胞培養至70%-80%融合時，0.4%胎牛血清DMEM培養基同步化處理細胞12h后，更換為完全培養基。乙醛刺激組給予不同濃度乙醛刺激，乙醛濃度分別為17.5μmol/L、87.5μmol/L、175μmol/L、350μmol/L、875μmol/L、1750μmol/L、2650μmol/L、3500μmol/L，刺激時間為24h，每12h補加乙醛一次;空白對照組加等體積培養基。各組培養24h后，加入5mg/ml MTT 200μl，37℃孵育4h，吸棄孔內上清液，各孔加入二甲基亞楓200μl，低速震蕩10min，以溶解被還原的MTT結晶，用酶標儀雙波長（測定波長490nm，參考波長630nm）檢測各孔吸光度值，計算不同濃度下乙醛刺激HSC增殖率與存活率。

增值率=[(乙醛組A值/對照組A值)－1]×100%

存活率=(乙醛組A值/對照組A值)×100%

1.2.4 MTT法觀察不同刺激時間乙醛對HSC增殖的影響:細胞計數、接種于96孔板中培養同上。乙醛刺激組選擇最佳濃度350μmol/L，分別刺激12h、24h和36h，每12h補加一次乙醛，對照組加等體積培養基。各孔加5mg/ml MTT 200μl，37℃孵育4h，吸棄孔內上清液，各孔加入二甲基亞楓200μl，低速震蕩10min，以溶解被還原的MTT結晶，酶標儀雙波長(測定波長490nm，參考波長630nm）檢測各孔吸光度值，計算乙醛刺激不同時間點的HSC增殖活性。

2 結果

2.1 MTT法觀察不同濃度乙醛對HSC增殖的影響 MTT法檢測結果顯示，乙醛在17.5μmol/L至2650μmol/L濃度梯度下刺激HSC，均有較好的增殖率，和對照組比較，差異有顯著意義(P＜0.01)，細胞存活率在100%以上，且以350μmol/L刺激增殖效果最好。但乙醛濃度增至875μmol/L以上時，細胞殖值率開始下降，且存活率低于100%;當乙醛濃度增至3500μmol/L時，細胞增殖率呈現負值，提示隨著乙醛刺激濃度的增加，乙醛對HSC產生毒性反應。因此，選擇增殖率和存活率均大于100%的濃度(350μmol/L)作為最佳實驗濃度。見表1。

表1 不同濃度乙醛對HSC增殖及存活率的影響

2.2 MTT法檢測乙醛刺激不同時間對HSC增殖的影響 選擇乙醛刺激HSC增殖的最佳濃度，各組大鼠HSC培養12h、24h和36h，MTT法檢測結果顯示，對照組細胞增殖基本一致，乙醛組在加入乙醛后，細胞數量開始增加，隨著刺激時間的延長增殖明顯提高，和對照組比較，差異有統計學意義(P＜0.01)。乙醛刺激24h細胞增殖活性達高峰。表明350μmol/L刺激24h是大鼠HSC增殖的最佳濃度和最佳時間。見表2。

表2 乙醛刺激HSC增殖不同時間點的MTT測定結果[MTT法(A值)]

3 討論

肝纖維化是各種慢性肝病發展為肝硬化的必經病理過程，而酒精性肝損傷是造成肝纖維化的主要病因之一。肝星狀細胞活化、增殖在酒精性肝纖維化形成中起關鍵作用。研究表明，乙醇的代謝產物乙醛可刺激肝星狀細胞增殖，是導致酒精性肝纖維化發生的關鍵因素[3]。本研究選擇乙醛作為致病因子進行體外研究，通過MTT法觀察乙醛刺激大鼠HSC增殖的最佳濃度和最佳時間。實驗結果顯示，在一定范圍內乙醛刺激HSC增殖呈現先增后減的量效關系，350μmol/L乙醛刺激HSC的增殖率和存活率均達到最佳狀態。實驗結果進一步顯示，選擇350μmol/L乙醛作為刺激濃度作用于大鼠HSC，隨著刺激時間的延長，HSC增殖亦呈現先增后減的時效關系，且24h是乙醛刺激細胞增殖的最佳時間。因此，選擇350μmol/L乙醛刺激24h可以成為比較理想的體外酒精性肝纖維化實驗模型，可為后續探討酒精性肝纖維化的發病機制及防治作用的研究提供可靠的實驗依據。

[1]趙箐.酒精性肝纖維化中肝星狀細胞活化的機制研究進展[J].國外醫學藥學分冊，2006,33(3):198-203.

[2]陳川寧，陶忠樺，李紅.乙醛對大鼠肝星狀細胞株HSC-T6激活、增殖及轉分化的影響[J].瀘州醫學院學報,2011,34(3): 217-220.

[3]蔣明德，甘新宇，解方為，等.乙醛對大鼠HSC增殖及膠原基因表達影響的實驗研究[J].西南國防醫藥，2002,12(2): 97-100.

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1004-6879(2013)05-0438-02

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