白介素-1β通過上調血管內皮細胞中FucT-Ⅶ及蛋白糖基化調控細胞間黏附作用

琚娜娜，吳明軍，趙德璋，屈茹楠，王應雄，楊 竹，于 超

(重慶醫科大學生命科學研究院，重慶 400016)

動脈粥樣硬化是一種血管內皮損傷導致的以炎癥反應為特點的血管壁病變型慢性疾病［1－2］。在炎癥初期，炎癥局部毛細血管后微靜脈擴張，內皮細胞與單核細胞間黏附親和能力增強，使之沿著血管內皮細胞表面滾動、活化、變形，穿過血管內皮細胞到血管外，移行到炎癥區域釋放炎癥介質，介導炎癥反應。內皮細胞與單核細胞的黏附這一過程涉及單核-內皮細胞諸多黏附分子，如選擇素、趨化因子及整合素家族之間的相互作用。內皮細胞膜上的選擇素配體為糖蛋白，其糖鏈能通過影響肽鏈的折疊改變整個蛋白分子的結構與功能［3］。因此探討內皮細胞膜上功能蛋白的糖基化機制對揭示內皮-單核細胞相互作用起著至關重要的作用，并且與動脈粥樣硬化的發生、發展密切相關。

唾液酸化的路易斯酸X(sialyl-Lewis X，sLex)糖支鏈是唾液酸化蛋白在巖藻糖基轉移酶家族(FucT)的催化作用下，將巖藻糖以α1，3-糖苷鍵的形式連接到N-乙酰葡萄糖胺上形成［4］。FucT-Ⅶ是巖藻糖基轉移酶家族的一個亞型，定位于高爾基體膜上，是Ⅱ類跨膜拓撲結構，N端有14個氨基酸位于細胞質，接著為19個氨基酸的疏水跨膜區及高爾基體內的催化結構域［5］。在腫瘤的研究中，sLex被證明與乳腺癌細胞的高轉移性有關［6］，在結腸癌及前列腺癌細胞中，sLex參與調控與活化內皮細胞間的黏附［7］，在哮喘疾病中sLex修飾表皮生長因子受體來調控上皮的修復［8］。已有文獻表明，唾液酸化的選擇素配體的巖藻糖基化修飾主要由兩種α1，3-巖藻糖基轉移酶調控即 FucT-Ⅶ和 FucT-Ⅳ，其中FucT-Ⅶ起主要作用［9－10］。白細胞膜上 P-選擇素配體(PSGL1，CD1)經過sLex糖鏈修飾后，與P-選擇素的親和力增強［11－12］。目前，在內皮細胞 EA.hy926是否存在FucT-Ⅶ的調控作用未見報道，本文運用IL-1β構建炎癥損傷細胞模型。采用siRNA干擾技術，對血管內皮細胞中FucT-Ⅶ、sLex糖支鏈蛋白差異表達進行分析，旨在探討炎癥反應中FucT-Ⅶ的糖基化修飾作用在血管內皮細胞與白細胞的黏附這一生物學功能之間的關系，為臨床上相關疾病的炎癥誘發機制提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料RPMI 1640培養基購自美國Gibco公司，胎牛血清購自美國Gibco公司和杭州四季青生物有限公司，內皮細胞生長因子 HAT及鼠源抗FucT-Ⅶ抗體購自Sigma公司，重組人源白介素1β(IL-1β)購自PeproTech公司，TRIzol裂解液購自大連寶生物工程有限公司，逆轉錄試劑盒購自Fermentas公司，SYBR Supermix試劑盒購自 BIO-RAD公司，化學合成siRNA購自上海吉瑪公司，Effectene轉染試劑盒購自QIAGEN公司，蛋白裂解液及兔源抗β-actin購自CST公司，鼠源抗sLex和ECL化學發光液購自Millipore公司，BCECF-AM染液購自碧云天生物有限公司，96孔板、24孔板及6孔板均購自Costar公司。二抗均購于北京中杉金橋生物技術有限公司。其他試劑均為國產分析純。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養及藥物處理 EA.hy926人臍靜脈內皮細胞用含10%胎牛血清、30 mg·L－1HAT生長因子添加物的RPMI1640培養基(含1×105U·L－1青霉素，100 mg·L－1鏈霉素)，人源單核細胞株THP-1用含20%胎牛血清的RPMI 1640培養基(含1 ×105U·L－1青霉素，100 mg·L－1鏈霉素)，兩者均于37℃、5%CO2飽和濕度培養箱內培養。待細胞生長至對數生長期后，取一定量細胞接種于培養板或培養瓶中，培養24 h后加入不同濃度的IL-1β(10、100 μg·L－1)的培養液(含 1% 胎牛血清的RPMI1640培養基)中處理24 h，空白對照組僅為相同體積的培養基，提取蛋白采用Western blot方法檢測各項指標或后續的黏附實驗。

1.2.2 Real-time PCR檢測FucT-Ⅶ 細胞培養同前，分組為對照組及不同濃度 IL-1β(10、100 μg·L－1)組，處理24 h。根據TRIzol試劑盒說明書抽提細胞總RNA，Fermentas試劑盒逆轉錄合成cDNA，反應條件為:65℃ 5 min，42℃ 60 min，70℃ 5 min。熒光定量PCR擴增FucT-Ⅶ基因產物，反應體系:SYBR green mix 5 μl，上、下游引物各 0.3 μl，cDNA 1 μl，RNase-free H2O 3.4 μl。反應條件:95℃ 3 min，95℃ 10 s，60℃ 30 s，循環 40 次，65℃ ～95℃條件下檢測溶解曲線。引物:FucT-Ⅶ，上游:5'-GGG CAG AGA TAA AAG GAG CAC-3'，下游:5'-CAG TCT CCC AGG ATC AGT CAG-3'，產物 131 bp;β-actin，上游:5'-ACG GCA TCG TCA CCA ACT G-3'，下游:5'-GAG CCA CAC GCA GCT CAT T-3'，產物 155 bp。

1.2.3 細胞轉染 取一定量處于對數生長期的細胞接種于培養瓶中，待長至70%左右時加入80 nmol·L－1的 siRNA(NC siRNA 序列:sense:5'-UUC UCC GAA CHU GUC ACG UTT-3'，Anti-sense:5'-ACG UGA CAC GUU CGG AGA ATT-3';FucT-ⅦsiRNA序列:sense:5'-CCA AGU CUA UGA GGA CCU UTT-3'，Anti-sense:5'-AAG GUC CUC AUA GAC UUG GTT-3')，72 h后提取蛋白采用Western blot方法檢測各項指標或后續的黏附實驗。

1.2.4 Western blot分析 收集處理后的細胞，加入CST裂解液(含10%Tyr抑制劑、10%Thr/Ser抑制劑、10%PMSF)裂解細胞提取總蛋白，用BCA法測定蛋白濃度，加入相應5×上樣buffer混勻，沸水煮10 min，－80℃保存。根據目的蛋白相對分子量大小，配制不同濃度的SDS-PAGE凝膠，每孔上樣蛋白量為40 μg，經過電轉至PVDF膜，5%脫脂牛奶或3%BSA 封閉 1 h，4℃孵育一抗(抗 FucT-Ⅶ，sLex及β-actin)搖床過夜，用TBST漂洗3次。再與辣根過氧化酶偶聯的二抗室溫孵育1 h。用ECL化學發光顯影，在ChemDoc成像儀(Bio-Rad，USA)分析結果。

1.2.5 內皮細胞-單核細胞黏附實驗 收集處理后的EA.hy926，取一定量接種于96孔板中，待細胞長滿后，加入已用 BCECF-AM(10 μmol·L－1終濃度)染色1 h的單核細胞THP-1，2×104/孔進行共培養，1 h后PBS漂洗2次后去除未黏附的THP-1細胞。倒置熒光顯微鏡下觀察并采圖計數，激發波長480 nm，發射波長530 nm。

1.2.6 細胞計數和統計學方法 采用Image-proplus 6.0軟件進行圖片分析和細胞計數，以計算黏附細胞數量并計算實驗組對空白組相對比值。每批實驗至少重復3次，每組至少3個復孔，結果用±s表示，應用SPSS 12.0軟件進行統計學分析，兩組間差異采用t檢驗分析，多組間比較采用方差分析。

2 結果

2.1 IL-1β對EA.hy926細胞活力的影響為了在建立細胞損傷模型時避免炎癥因子對細胞活力產生直接的影響，經篩選選擇IL-1β作用濃度為10 μg·L－1、100 μg·L－1，觀察其對細胞形態的影響并測定相應的細胞活力。結果顯示，不同濃度 IL-1β(10、100 μg·L－1)處理24 h 后，細胞形態未發生明顯變化(Fig 1A)。采用羅氏細胞計數儀檢測細胞活力，3組細胞存活率分別為91.1%、90.4%、90.5%(Fig 1B)。表明在此濃度范圍內IL-1β對細胞活力不會產生明顯影響，可以用于構建炎癥損傷模型。

2.2 IL-1β促進內皮-單核細胞間黏附能力為了考察炎癥模型下，血管內皮細胞的生物功能是否改變，以不同濃度 IL-1β(10、100 μg·L－1)處理 EA.hy926細胞，然后采用熒光標記的單核細胞與其共培養。結果顯示與對照組相比，內皮細胞與單核細胞的黏附能力明顯增強，且呈濃度依賴關系(Fig 2)。表明炎癥模型建立成功。

Fig 1 Effects of IL-1β with different concentrations on EA.hy926 cells

2.3 IL-1β上調內皮細胞中FucT-Ⅶ及sLex糖支鏈的表達為了驗證IL-1β是否影響細胞內糖基化轉移酶表達，進而對功能蛋白糖基化進行調控。采用Real time-PCR、Western blot和凝集素免疫印跡方法，分別從mRNA和蛋白水平上對FucT-Ⅶ及sLex糖支鏈表達進行分析。結果顯示不同濃度IL-1β(10、100 μg·L－1)處理 EA.hy926 細胞 24 h 后，與對照組相比較，FucT-Ⅶ的mRNA表達水平上調(見Fig 3A);FucT-Ⅶ蛋白表達及細胞內sLex糖支鏈蛋白的表達水平明顯上調(Fig 3B)。表明EA.hy926細胞經過IL-1β處理后，通過FucT-Ⅶ的上調，促進其底物靶蛋白的sLex糖支鏈表達量升高，這與細胞黏附功能密切相關。

2.4 干擾FucT-Ⅶ表達細胞模型的建立為了進一步驗證FucT-Ⅶ與細胞黏附功能有關，首先構建siRNA干擾細胞模型，通過siRNA干擾 EA.hy926細胞中FucT-Ⅶ的表達，采用Western blot方法檢測細胞中FucT-Ⅶ及sLex糖支鏈的蛋白表達。結果顯示，與對照組及空載組(NC)比較，siRNA組中FucT-Ⅶ蛋白表達水平下調，sLex糖支鏈的蛋白量相應被抑制(Fig 4)，表明成功建立了FucT-Ⅶ干擾的細胞模型。

Fig 2 Effects of IL-1β treatment for 24h on endothelial-monocyte adherence

Fig 3 Expression of FucT-Ⅶ mRNA，FucT-Ⅶ protein and fucosylated-protein in EA.hy926 cells after IL-1β treatment

Fig 4 Expression of FucT-Ⅶ protein and total fucosylated-protein in EA.hy926 cells before and after FucT-Ⅶ siRNA transfection

Fig 5 Effects of EA.hy926 cells adhesion to monocytes after siRNA FucT-Ⅶtransfection

2.5 干擾FucT-Ⅶ表達能夠下調細胞間黏附能力為了驗證FucT-Ⅶ對細胞的黏附能力的影響，比較了干擾模型與對照組中內皮-單核細胞黏附能力的差異。結果顯示siRNA干擾組與對照組及空載組(NC)細胞相比，單核細胞對其黏附能力明顯下降(Fig 5)。表明FucT-Ⅶ可能通過對功能蛋白糖基化作用影響內皮細胞與單核細胞的相互作用。因此，在炎癥情況下FucT-Ⅶ表達量的上調可能也是內皮細胞與單核細胞的黏附能力增強的原因之一。

3 討論

細胞表面糖蛋白的糖支鏈對細胞-細胞、細胞-分子的識別非常重要，不同類型的糖鏈分別參與配體識別結合、信號轉導、黏附及胚泡著床過程。各種糖蛋白或多或少的與細胞生長、凋亡、分化等重要生命過程密切相關。蛋白糖基化的改變將影響黏附分子的結構與功能，從而調控細胞與細胞間的相互作用［13］。其中蛋白巖藻糖基化參與多種生物學過程，巖藻糖基化異常被發現與多種疾病有關。巖藻糖基轉移酶(fucosyltransferase，FucT)是調控這種糖基化作用的關鍵酶，它是一類將GDP巖藻糖中的巖藻糖基轉移至糖鏈上N-乙酰氨基乳糖單位的N-乙酰氨基葡萄糖(GlcNAc)上，并以α-巖藻糖苷鍵相連接的酶［3］。FucT-Ⅶ是巖藻糖基轉移酶家族的一個亞型，相較于其他酶，FucT-Ⅶ對底物具有專一性，它只能形成sLex而不是其他的Lewis抗原。sLex常參與胚胎發育、器官形成，并且和造血細胞分化及腫瘤的發生、浸潤有關，常作為腫瘤轉移標志物［14］。FucT-Ⅶ在小鼠體內是選擇素受體合成過程中的關鍵酶，能夠抑制其動脈粥樣硬化程度［15］，且 FucT-Ⅶ及sLex的高表達對E-選擇素蛋白和P-選擇蛋白介導的白細胞黏附作用［16］及腫瘤的黏附、遷移、侵襲能力［17］的影響已見報道，但炎癥因子對內皮細胞EA.hy926中FucT-Ⅶ與蛋白巖藻糖基化及細胞功能的影響尚未見報道。IL-1β是白細胞介素1細胞因子家族的成員之一，可以導致血管內皮功能紊亂，已有研究顯示IL-1β可通過對整合素β1的糖基化修飾調控細胞凋亡［18］。因此，本實驗用 IL-1β(10、100 μg·L－1)處理細胞24 h后，發現內皮細胞與單核細胞THP-1黏附能力增強;通過定量PCR和蛋白免疫印跡的方法檢測到FucT-Ⅶ的mRNA和蛋白表達水平與細胞總蛋白的糖支鏈sLex呈正相關，與對照組比較，差異有統計學意義。為進一步驗證炎癥因子誘導FucT-Ⅶ表達上調與細胞間黏附能力有關，采用siRNA技術干擾細胞中FucT-Ⅶ表達后，發現sLex表達下調，同時內皮細胞與單核細胞的黏附能力也降低。這說明內皮細胞膜上靶蛋白經巖藻糖基化修飾后能夠增強內皮細胞與單核細胞的黏附能力，那么哪些蛋白參與巖藻糖基化過程?炎癥因子通過FucT-Ⅶ的糖基化修飾調控細胞間黏附作用的相關分子機制研究將成為本課題組今后研究的主要方向。

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