關(guān)于中醫(yī)防治骨質(zhì)疏松癥研究中動物模型的選用

付小衛(wèi)，宋長恒，王如然，劉梅潔，王 瑩，周晟芳

(1.陜西中醫(yī)學(xué)院中西醫(yī)臨床醫(yī)學(xué)院，陜西 咸陽 712046;2.中國中醫(yī)科學(xué)院中醫(yī)基礎(chǔ)理論研究所，北京 100700;3.中國中醫(yī)科學(xué)院廣安門醫(yī)院南區(qū)，北京 102618)

骨質(zhì)疏松癥(osteoporosis，OP)是以骨量減少(osteopenia)、骨的微觀結(jié)構(gòu)退化、導(dǎo)致骨脆性增加、易發(fā)生骨折為特征的一種全身代謝性骨病(2001年世界衛(wèi)生組織提出)。OP是一個具有顯著病理生理、社會心理和經(jīng)濟(jì)后果的健康問題，它的嚴(yán)重后果是發(fā)生脆性骨折(即在受到輕微創(chuàng)傷或日常活動中就可發(fā)生骨折)，從而大大增加了老年人的病殘率和死亡率。隨著我國人口老齡化趨勢日益加劇，其發(fā)病率在不斷上升，這就迫切要求對其發(fā)病機(jī)制、藥物作用機(jī)理有深入認(rèn)識，從而提出更新、更科學(xué)的防治方法和手段。這一切都需要醫(yī)藥科研人員付出艱辛的努力。

近20年來，我國中醫(yī)藥科研工作者也致力于OP的病因病機(jī)、單味或復(fù)方中草藥作用機(jī)制及新藥開發(fā)的科學(xué)研究，取得了一定成績，積累了不少經(jīng)驗(yàn)。動物模型作為科研的重要手段，有著無可替代的作用。本文就目前中醫(yī)藥科學(xué)研究中OP模型動物的選用進(jìn)行探討。

1 選用原則

在選用模型動物時首先應(yīng)考慮以下幾個方面［1］:(1)與人的機(jī)能、代謝、結(jié)構(gòu)及疾病特點(diǎn)相似;(2)遺傳穩(wěn)定;(3)遺傳背景明確;(4)資料完整便于交流，結(jié)果可靠;(5)動物經(jīng)濟(jì)、易飼養(yǎng)、操作簡便;(6)符合倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)和國際規(guī)范。另外，還需根據(jù)實(shí)驗(yàn)研究的目的以及不同動物種屬與人類骨的生物代謝特征選用適合的實(shí)驗(yàn)動物。

2 動物種類

2.1 非人類靈長類

嚙齒目動物是最適合作為OP研究的實(shí)驗(yàn)動物，常用的有恒河猴、獼猴等。此類動物是人類的近屬動物，身體多保持直立位，其組織結(jié)構(gòu)、生理和代謝功能等方面同人類相似，尤其是在其動情周期、月經(jīng)現(xiàn)象、骨生物力學(xué)特性和骨組織代謝等方面與人類極為相似，因而其作為OP模型動物的價值遠(yuǎn)非其他動物所能比擬。Colman R.J.等［2］研究指出，雄性恒河猴峰值骨密度在10歲左右出現(xiàn)，增齡性骨組織改變和骨代謝激素改變與人類相似，適合作為老年性骨質(zhì)疏松模型動物。然而，選用此類動物也存在以下不利因素:(1)飼養(yǎng)困難;(2)費(fèi)用昂貴;(3)馴養(yǎng)條件高;(4)實(shí)驗(yàn)操作難度大;(5)實(shí)驗(yàn)周期長;⑥易感染疾病。

2.2 嚙齒目動物

嚙齒目動物是最常用于OP研究的實(shí)驗(yàn)動物，常用的實(shí)驗(yàn)動物有大鼠(主要是 SD和 Wistar大鼠)、小鼠等。此類動物廉價、易飼養(yǎng)，是易于得到的特殊基因型的品系。但因其無皮質(zhì)骨的哈佛管骨重建現(xiàn)象，故不能用來觀察皮質(zhì)骨的變化［3］。

大鼠的自然壽命為2～3年，性成熟期2～3個月，是建立OP模型應(yīng)用最廣泛的動物。它的骨松質(zhì)分布及骨重建功能和人類相似，也會出現(xiàn)增齡性骨量丟失。雌性去勢大鼠(OVX)術(shù)后出現(xiàn)高骨轉(zhuǎn)化率、腸鈣吸收下降等。雌性大鼠在6～9個月骨骺開始閉合，進(jìn)入與人類相似的骨代謝相對穩(wěn)定的骨生長靜止期，10個月達(dá)到峰值骨量，較雄性大鼠骨生長靜止期時間早，有利于實(shí)驗(yàn)時機(jī)和周期的把握。目前OP研究中已經(jīng)有了完備的大鼠骨組織形態(tài)及形態(tài)計量學(xué)、生物力學(xué)及骨密度等研究方法，通過這些方法已能建立各種成熟的OP模型［4］。

小鼠雖然是醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中用途最廣泛和最常用的動物，但由于其可采集的血量少、骨標(biāo)本少等，少有報道其作為OP模型動物。骨質(zhì)疏松癥的遺傳學(xué)研究是骨生物學(xué)研究中最活躍的領(lǐng)域之一，因小鼠的基因易于調(diào)控，采用基因敲除或轉(zhuǎn)基因的方法對其進(jìn)行骨代謝遺傳因素的研究，觀察其骨骼生理和病理變化，不僅有利于更好地了解OP的發(fā)病機(jī)制，也有利于更好地尋找該疾病診斷、預(yù)防和治療的方法。Kalu等［5］研究發(fā)現(xiàn)，C57BL去卵巢小鼠適宜用于研究絕經(jīng)后婦女腸內(nèi)鈣吸收不良。日本Jackson實(shí)驗(yàn)室培育的SAM/P6小鼠，具有比正常小鼠老化快的特點(diǎn)，可出現(xiàn)增齡性骨質(zhì)疏松和脆性骨折，是老年性骨質(zhì)疏松癥研究的良好模型動物［6］。

2.3 兔形目

研究表明，兔比鼠更接近人類，因而近年來兔作為OP模型動物逐漸受到研究者的青睞。兔的自然壽命為4～6年，性成熟期為5～8個月，1年以上達(dá)老年。選用兔作為OP模型動物的優(yōu)勢主要有:①性情溫順，大小適當(dāng)，繁殖力強(qiáng)，價廉易得，便于管理;②易于從耳緣靜脈取血，適合長期動態(tài)觀察;④骨組織發(fā)育、代謝與人類相似，兔適宜建立卵巢切除后、糖皮質(zhì)激素及肝素等誘導(dǎo)的 OP模型。楊霞等［7］通過觀察新西蘭純種雌性大白兔去勢5～8個月后骨密度、體重、毛色及生長狀況，處死后取骨作生物力學(xué)測定及病理組織學(xué)檢查等，認(rèn)為5月齡兔去勢后各項(xiàng)指標(biāo)均較1年齡明顯，術(shù)后半年OP模型即可基本建立。

2.4 食肉目

比格犬(又名小獵兔犬)是公認(rèn)的實(shí)驗(yàn)用犬，是可靠的 OP模型動物［8］。其優(yōu)勢在于:(1)屬小型犬，溫馴易捕，親近人，對環(huán)境適應(yīng)能力強(qiáng)，抗病力強(qiáng);(2)雜食性動物，胃腸系統(tǒng)及鈣磷代謝方面與人相似;(3)皮質(zhì)骨與松質(zhì)骨的比例與人骨相似;(4)哈佛單位和松質(zhì)骨重建與人形態(tài)相似;(5)可做多次骨活檢，便于反復(fù)、長期觀察。但比格犬在1年中僅有2次發(fā)情期(春、秋天)，骨組織生長代謝對雌激素的依賴性相對較小，特別是其卵巢和子宮切除并不足以引起明顯的骨丟失，這些都限制了其作為OP模型動物進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究。

2.5 偶蹄目

常用的有小型豬和綿羊、山羊。(1)小型豬:上世紀(jì)50年代培育的小型豬已成為具有廣泛應(yīng)用前景的實(shí)驗(yàn)動物［9］。它的一般生物學(xué)特性與普通家豬基本相同，只是成年體重較輕(6月齡約30kg，微型豬最小約15 kg)更便于實(shí)驗(yàn)操作。小型豬之所以可選用為OP模型動物，是因其具有與人相似的連續(xù)發(fā)情周期(每次18～21d);骨骼發(fā)育及礦物質(zhì)代謝與人頗為相似;骨骼大，足以接受人工裝置的植入;可多次取血、采活檢;性格溫順，易于調(diào)教。小型豬是雜食性動物，有與人類相似的胃腸道結(jié)構(gòu)，因而也是人體消化道功能的最佳模型［10，11］;②綿羊和山羊:羊是作為OP模型極具潛力的實(shí)驗(yàn)動物。綿羊性情溫順、容易圈養(yǎng)和處置，相對較便宜，體型較大，能大量取血、尿標(biāo)本和骨組織活檢標(biāo)本;共髂嵴與人相似，便于安裝人工植入體，氟化物在骨的沉積和對骨細(xì)胞的毒性反應(yīng)方面與人類相似;發(fā)情期14～21d，自發(fā)性排卵、激素分泌情況與女性相似;7～9歲年老綿羊依次在股骨的尾部、肱骨和橈骨的骨干發(fā)生哈佛系統(tǒng)的重建［12］。作為 OP模型，山羊與綿羊有許多相似的之處，已被證明是合適的OP模型動物。但應(yīng)注意的是，羊是反芻類動物，胃腸道系統(tǒng)與人不同，不適合于口服給藥，需要時可采取建立胃瘺管。

2.6 其他

目前以鳥類、馬、牛等動物作為OP模型動物的報道極少。

在中醫(yī)藥科研中，選用人體作為實(shí)驗(yàn)對象進(jìn)行研究，無論從道義還是方法上都受到不少限制，困難重重，因而絕大部分實(shí)驗(yàn)要用實(shí)驗(yàn)動物進(jìn)行。一個科學(xué)合理的實(shí)驗(yàn)動物模型是進(jìn)行疾病相關(guān)研究的關(guān)鍵，否則將會把醫(yī)學(xué)科學(xué)研究引入歧途，得出錯誤的結(jié)論。目前，在中醫(yī)藥研究OP動物實(shí)驗(yàn)中，常選用非人類靈長類動物及大、小鼠、兔、犬、羊、豬等作為模型動物。但無論哪種實(shí)驗(yàn)動物，在OP科研中都有各自的優(yōu)點(diǎn)和不足，加之人類OP本身是一種漸進(jìn)的、慢性的、多因素致病的骨代謝綜合征，至今還沒有任何一種實(shí)驗(yàn)動物能夠達(dá)到完全理想的模擬效果。因而，中醫(yī)藥科研工作者應(yīng)該根據(jù)所研究目的不同，充分考慮各種實(shí)驗(yàn)動物骨的生物代謝特點(diǎn)，盡量選擇與人相似度高、重復(fù)性好、經(jīng)濟(jì)易行的實(shí)驗(yàn)動物制作OP模型。

［1］ 崔燎，吳鐵.骨質(zhì)疏松藥理學(xué)動物實(shí)驗(yàn)與圖譜［M］.北京:科學(xué)出版社，2011:64-69.

［2］ Colman RJ，Lane MA，Binkley N，et al.Skeletal effects of aging in male rhesus monkeys［J］.Bone，1999，24(1):17-23.

［3］ Thompson DD，Simmons HA，Pirie CM.FDA guidelines and animal models for osteoporosis［J］.Bone，1995，17:125-133.

［4］ Ikeda S，Tsurukami H，Ito M，et al.Effect of trabecular bone contour on ultimate strength of lumbar vertebra after bilateral ovariectomy in rats［J］.Bone，2001，28(6):625-633.

［5］ Kalu DN， Chen C. Ovariectomized murine model of postmenopausal calcium malabsorption［J］.J Bone Miner Res，1999，14:593-601.

［6］ Manolagas SC.Birth and death of bone cells:basic regulatory mechanisms and implications for the pathogenesis and treatment of osteoporosis［J］.Endocr Rev，2000，21(2):115-137.

［7］ 楊霞，蔡桂英，魏跺，等.去勢兔骨質(zhì)疏松模型建立的初探［J］.生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)雜志，1997，14(4):353-358.

［8］ Branemark R，Ohrnell LO，Skala R，et al.Biomechanical characterization of osteointegration:an experimental in vivo investigation in the beagle dog［J］.J Orthop Res，1998，16(1):61-69

［9］ Kraeling RR，Barb CR，Rampacek GB，et al.Luteinizing hormone response to controlled-release deslorelin in estradiol benzoate primed ovariectomized gilts［J］.Theriogenology，2000，53(9):1681-1689.

［10］ 劉和娣，李星海，佟曉旭，等.地塞米松與維甲酸致大鼠骨質(zhì)疏松動物模型的比較［J］.中國病理生理雜志，2004，20(4):697-699.

［11］ Bellino FL.Nonprimate animal models of menopause:workshop report［J］.Menopause，2000，7(1):14-24.

［12］ Kimmel DB.Animal model for in vivo experimentation in osteoporosis research.CI.In:Marcus R，F(xiàn)eldman K，Kelsey Jeds.Osteoporosis［J］.New York:Academic Press，1996，671-696.