ATP 受體通道激活增加谷氨酸對海馬神經(jīng)元的損傷

李曉娟，郭直岳，王亞莉，趙建華，白瑞櫻，路承彪

研究表明，ATP 不僅是組織細胞的供能物質(zhì)，還是一種具有興奮性作用的神經(jīng)遞質(zhì)，能調(diào)節(jié)中樞神經(jīng)系統(tǒng)快速的神經(jīng)傳遞。神經(jīng)末梢突觸囊泡內(nèi)儲存著ATP 并能在特定的刺激下釋放［1］。正常情況下，釋放到胞外的ATP 量很少，當腦受到損傷(如缺血缺氧)時，大量ATP 釋放到胞外，使胞外的ATP 水平迅速升高，與細胞膜上的受體結(jié)合，繼而引發(fā)系列反應，使細胞膜通透性增加，導致細胞凋亡壞死，引起繼發(fā)性腦損傷［2］。ATP 受體屬于P2 嘌呤能受體，分為P2X 受體和P2Y 受體兩類。P2X 受體是一種非選擇性的陽離子通道蛋白，允許一價陽離子如Na+和K+及二價陽離子如Ca2+通過。P2Y 受體是G-蛋白耦聯(lián)的代謝型受體，該受體激活磷脂酶C(PLC)，導致鈣從肌漿網(wǎng)中釋放。

Glu 是人腦內(nèi)含量最高的興奮性氨基酸。正常情況下，谷氨酸參與多種生理功能的調(diào)控，但過量的谷氨酸對神經(jīng)元有損傷作用。許多病理情況如缺血、癲癇、神經(jīng)退行性疾病(阿爾茲海默癥和帕金森病、肌萎縮側(cè)索硬化癥)等都與谷氨酸興奮毒性介導的神經(jīng)細胞死亡密切相關(guān)［3］，Glu 受體有3 種，分別是NMDA、KA 和AMPA 受體。Glu 受體的過度激活引起Ca2+內(nèi)流增加被認為與這些病理改變有關(guān)。

Paul Brown［4］等發(fā)現(xiàn)，除了作為快速神經(jīng)遞質(zhì)外，ATP 還作為神經(jīng)系統(tǒng)一種興奮性谷氨酸能突觸所激活的產(chǎn)物，表明二者之間有一定的聯(lián)系。在大鼠皮層和海馬的錐體細胞中，P2 嘌呤能受體拮抗劑能改變谷氨酸的NMDA、KA 或AMPA 受體。近期的研究表明P2X 受體和AMPA 受體共同存在于小腦和海馬的興奮性突觸后膜上，在興奮性突觸上P2X 受體亞基的出現(xiàn)表明谷氨酸能和嘌呤能傳遞之間存在相互作用［5］。

因此本研究假設ATP 信號通路可能改變了神經(jīng)退行性變的過程，研究采用ATP、Glu 單獨或共同處理原代培養(yǎng)的海馬神經(jīng)元觀察細胞死亡情況，通過全細胞電壓鉗放大器記錄海馬神經(jīng)元電流變化，探討胞外ATP、Glu 對海馬神經(jīng)元的作用及其機制。

1 材料和方法

1.1 材料 孕鼠購自鄭州大學動物中心［許可證號:scxk(豫)2005-0001］;ATP、glutamate、谷氨酰胺、胰蛋白酶均購自Sigma 公司;DMEM、NB(neurobasal)、B27 培養(yǎng)基、胎牛血清均購自Gibco 公司;Axon 全細胞電壓鉗放大器購自Molecular Device。

1.2 方法

1.2.1 海馬神經(jīng)元培養(yǎng)［6］及實驗分組 孕18d 胎鼠迅速取出海馬組織，置于D-Hanks 液中洗滌3 次，剪碎加入終濃度0.125%胰蛋白酶消化液中，37℃消化20min，用含10% 胎牛血清的冰冷DMEM 液中止消化，靜置2min 去除中止液，加入DMEM 液制成7×105cells/L 密度的細胞懸液，接種于涂有0.05%多聚賴氨酸的培養(yǎng)皿中(35mm)，6h后更換NB+B27+谷氨酰胺培養(yǎng)基，3d 后半量換液，37℃恒溫CO2孵箱內(nèi)培養(yǎng)。細胞培養(yǎng)至第7 天進行實驗。實驗分為正常對照組、ATP 組、Glu 組和ATP+Glu 組。正常對照組:NB+B27 培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng);ATP 組:更換為特定濃度的ATP 工作液后觀察;Glu 組:更換為特定濃度的Glu 工作液后觀察;ATP+Glu 組:更換為特定濃度的ATP+Glu 工作液后觀察。

1.2.2 海馬神經(jīng)元存活率檢測 用0.125%的胰蛋白酶消化貼壁的神經(jīng)元，并用含15%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基中止消化，充分吹打細胞懸液，取9 滴細胞懸液移入試管中，加1 滴0.4%臺盼藍溶液混勻，3min 內(nèi)用血細胞計數(shù)板在倒置相差顯微鏡下分別計數(shù)活細胞和死細胞(藍染細胞)。神經(jīng)元存活率=未藍染細胞/(藍染細胞+未藍染細胞)×100%，實驗重復3 次。

1.2.3 全細胞或膜外面向外式膜片鉗記錄同先前使用方法［7］。打開數(shù)模轉(zhuǎn)換器和膜片鉗放大器，通過顯微鏡和CCD 可視下挑選狀態(tài)較好、突觸完整、邊界折光度好的神經(jīng)元;電極電阻大約為3-5M，高阻抗封接，形成全細胞記錄模式。應用膜片鉗放大器記錄電流，2kHz 濾波，采樣頻率為5kHz(Digidata 1320，Axon Instruments)，pCLAMP-8 型軟件進行數(shù)據(jù)記錄和分析。

1.3 統(tǒng)計學處理 所有統(tǒng)計均采用SPSS13.0軟件在計算機上進行隨機區(qū)組設計的單因素方差分析(one-way ANOVA)，各組數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差(±s)表示。

2 結(jié)果

2.1 ATP 和Glu 對細胞死亡率的影響 相差顯微鏡顯示正常培養(yǎng)條件下。海馬神經(jīng)元折光性強，胞體飽滿，有明顯的立體感，周圍有一圈亮暈，神經(jīng)突起多并延長交織成網(wǎng)狀。采用ATP(100μmol/L)、Glu(100μmol/L)以及ATP+Glu(100μmol/L+100μmol/L)分別處理后，觀察到明顯神經(jīng)元細胞死亡，細胞形態(tài)變圓，突起變短，臺盼藍計數(shù)細胞存活率，對照組存活率在90%以上，采用ATP(100μmol/L)、Glu(100μmol/L)以及ATP+Glu(100μmol/L+100μmol/L)分別處理原代培養(yǎng)的海馬神經(jīng)元24h。單獨給予低劑量ATP 引起大約30%的神經(jīng)元死亡，單獨給予Glu 引起大約50%的神經(jīng)元死亡，ATP 和Glu 聯(lián)合給予引起接近100% 神經(jīng)元死亡(P＜0.05)。

2.2 ATP 和Glu 誘導的全細胞電流 在離體培養(yǎng)7d 的海馬神經(jīng)元上，固定膜電位在－70mV，記錄全細胞電流。低劑量ATP(100μmol/L)誘導的電流很微弱，Glu(100μmol/L)可誘導約300pA 的內(nèi)向電流(P＜0.05)，ATP(100μmol/L)和Glu(100μmol/L)聯(lián)合應用誘導較大的內(nèi)向電流(P＜0.05)。三者之間的比較，表明ATP 提高了谷氨酸誘導的電流。

2.3 膜外面向外式(outside-out)膜片鉗記錄ATP 和Glu 誘導的離子電流 在全細胞記錄完成后，開始膜片鉗記錄。單獨應用ATP(100μmol/L)沒有誘導明顯的內(nèi)向電流，單獨應用Glu(100μmol/L)誘導了微弱的內(nèi)向電流，二者同時使用誘導了較大的內(nèi)向電流(P＜0.05)，表明ATP 提高了Glu 誘導的內(nèi)向電流。

3 討論

興奮性毒性是由興奮性神經(jīng)遞質(zhì)對受體的過度持續(xù)活化導致的神經(jīng)元死亡過程［8］。20 世紀50 年代Holtol 發(fā)現(xiàn)感覺神經(jīng)興奮時釋放ATP，首次證實了ATP 可以作為神經(jīng)系統(tǒng)的遞質(zhì)，提示ATP 在神經(jīng)興奮傳遞中具有實際意義。ATP 與離子門控型P2X 受體結(jié)合可導致細胞膜通透性增加，促使大量Ca2+內(nèi)流，最終導致靶細胞死亡［2］。谷氨酸作為人腦內(nèi)含量最高的興奮性氨基酸，當其NMDA 受體過度興奮時大量Ca2+內(nèi)流，使細胞內(nèi)Ca2+超負荷，引起Ca2+穩(wěn)態(tài)失調(diào)，從而激活依賴于鈣的酶系統(tǒng)引起一系列的細胞損傷。

本實驗通過光學顯微鏡觀察到ATP 及Glu 作用于海馬神經(jīng)元后，細胞形態(tài)變圓，突起變短。臺盼藍計數(shù)顯示，ATP(100μmol/L)、Glu(100μmol/L)以及ATP+Glu(100μmol/L+100μmol/L)分別處理后海馬神經(jīng)元死亡率依次增加，表明ATP 受體通道激活與Glu 對海馬神經(jīng)元的損傷有協(xié)同作用。為進一步探討ATP 與Glu 對海馬神經(jīng)元的損傷機制，我們應用全細胞電壓鉗放大器，單獨給予ATP 與Glu 或聯(lián)合誘導全細胞電流和膜片鉗記錄電流。

實驗結(jié)果均表明，單獨給予100μmol/L ATP 沒有明顯的電流產(chǎn)生，可能與使用的ATP 劑量低有關(guān)，Skaper 等［2］報道ATP 引起的細胞死亡多為mmol 的劑量，而我們使用的劑量為μmol/L 級的;100μmol/L Glu 可誘導較大的內(nèi)向電流;二者共同作用增加了電流大小，表明ATP 與Glu 的協(xié)同作用。

Domercq 等［9］報道腦缺血損傷是由于ATP 失穩(wěn)態(tài)。腦缺血時ATP 釋放增多，激活P2X7 受體導致顯著的鈣超載，是卒中等缺血性疾病的關(guān)鍵。脊髓創(chuàng)傷［10］也與ATP 受體P2X7 激活導致的興奮性毒性有關(guān)，應用P2X7 抑制劑可減輕脊髓損傷。

谷氨酸引起的神經(jīng)元損傷更是被人們所公認作為興奮性神經(jīng)毒性模型復制的方法［11］。Eftinija等［12］報道體外培養(yǎng) Schwann 細 胞，給 予 ATP(100μmol/L)引起受體介導的興奮性遞質(zhì)谷氨酸和天冬氨酸增加，提示在膠質(zhì)細胞中ATP 可以提高谷氨酸濃度，這與我們在海馬神經(jīng)元培養(yǎng)中觀察到的ATP 受體通道激活增加谷氨酸對海馬神經(jīng)元的損傷結(jié)果是一致的。但是關(guān)于兩種興奮性遞質(zhì)對神經(jīng)元的共同作用并未見報道，本實驗結(jié)果提示ATP 和Glu 可能同時打開各自的受體通道導致更顯著的鈣超載，從而引起更嚴重的細胞損傷。

探討ATP 和Glu 對神經(jīng)元的作用，對與興奮毒性有關(guān)的紊亂諸如卒中等缺血性疾病、癲癇、阿爾茲海默癥和帕金森病、肌萎縮側(cè)索硬化癥等神經(jīng)退行性疾病的發(fā)病機制可能提供重要證據(jù)。在這些疾病的發(fā)生發(fā)展過程中可能存在這兩種受體通道的同時打開，從多個通道進行阻斷可能成為治療這些疾病的新的靶點。

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