ATP 受體通道激活增加谷氨酸對海馬神經元的損傷

李曉娟，郭直岳，王亞莉，趙建華，白瑞櫻，路承彪

研究表明，ATP 不僅是組織細胞的供能物質，還是一種具有興奮性作用的神經遞質，能調節中樞神經系統快速的神經傳遞。神經末梢突觸囊泡內儲存著ATP 并能在特定的刺激下釋放［1］。正常情況下，釋放到胞外的ATP 量很少，當腦受到損傷(如缺血缺氧)時，大量ATP 釋放到胞外，使胞外的ATP 水平迅速升高，與細胞膜上的受體結合，繼而引發系列反應，使細胞膜通透性增加，導致細胞凋亡壞死，引起繼發性腦損傷［2］。ATP 受體屬于P2 嘌呤能受體，分為P2X 受體和P2Y 受體兩類。P2X 受體是一種非選擇性的陽離子通道蛋白，允許一價陽離子如Na+和K+及二價陽離子如Ca2+通過。P2Y 受體是G-蛋白耦聯的代謝型受體，該受體激活磷脂酶C(PLC)，導致鈣從肌漿網中釋放。

Glu 是人腦內含量最高的興奮性氨基酸。正常情況下，谷氨酸參與多種生理功能的調控，但過量的谷氨酸對神經元有損傷作用。許多病理情況如缺血、癲癇、神經退行性疾病(阿爾茲海默癥和帕金森病、肌萎縮側索硬化癥)等都與谷氨酸興奮毒性介導的神經細胞死亡密切相關［3］，Glu 受體有3 種，分別是NMDA、KA 和AMPA 受體。Glu 受體的過度激活引起Ca2+內流增加被認為與這些病理改變有關。

Paul Brown［4］等發現，除了作為快速神經遞質外，ATP 還作為神經系統一種興奮性谷氨酸能突觸所激活的產物，表明二者之間有一定的聯系。在大鼠皮層和海馬的錐體細胞中，P2 嘌呤能受體拮抗劑能改變谷氨酸的NMDA、KA 或AMPA 受體。近期的研究表明P2X 受體和AMPA 受體共同存在于小腦和海馬的興奮性突觸后膜上，在興奮性突觸上P2X 受體亞基的出現表明谷氨酸能和嘌呤能傳遞之間存在相互作用［5］。

因此本研究假設ATP 信號通路可能改變了神經退行性變的過程，研究采用ATP、Glu 單獨或共同處理原代培養的海馬神經元觀察細胞死亡情況，通過全細胞電壓鉗放大器記錄海馬神經元電流變化，探討胞外ATP、Glu 對海馬神經元的作用及其機制。

1 材料和方法

1.1 材料 孕鼠購自鄭州大學動物中心［許可證號:scxk(豫)2005-0001］;ATP、glutamate、谷氨酰胺、胰蛋白酶均購自Sigma 公司;DMEM、NB(neurobasal)、B27 培養基、胎牛血清均購自Gibco 公司;Axon 全細胞電壓鉗放大器購自Molecular Device。

1.2 方法

1.2.1 海馬神經元培養［6］及實驗分組 孕18d 胎鼠迅速取出海馬組織，置于D-Hanks 液中洗滌3 次，剪碎加入終濃度0.125%胰蛋白酶消化液中，37℃消化20min，用含10% 胎牛血清的冰冷DMEM 液中止消化，靜置2min 去除中止液，加入DMEM 液制成7×105cells/L 密度的細胞懸液，接種于涂有0.05%多聚賴氨酸的培養皿中(35mm)，6h后更換NB+B27+谷氨酰胺培養基，3d 后半量換液，37℃恒溫CO2孵箱內培養。細胞培養至第7 天進行實驗。實驗分為正常對照組、ATP 組、Glu 組和ATP+Glu 組。正常對照組:NB+B27 培養基常規培養;ATP 組:更換為特定濃度的ATP 工作液后觀察;Glu 組:更換為特定濃度的Glu 工作液后觀察;ATP+Glu 組:更換為特定濃度的ATP+Glu 工作液后觀察。

1.2.2 海馬神經元存活率檢測 用0.125%的胰蛋白酶消化貼壁的神經元，并用含15%胎牛血清的DMEM 培養基中止消化，充分吹打細胞懸液，取9 滴細胞懸液移入試管中，加1 滴0.4%臺盼藍溶液混勻，3min 內用血細胞計數板在倒置相差顯微鏡下分別計數活細胞和死細胞(藍染細胞)。神經元存活率=未藍染細胞/(藍染細胞+未藍染細胞)×100%，實驗重復3 次。

1.2.3 全細胞或膜外面向外式膜片鉗記錄同先前使用方法［7］。打開數模轉換器和膜片鉗放大器，通過顯微鏡和CCD 可視下挑選狀態較好、突觸完整、邊界折光度好的神經元;電極電阻大約為3-5M，高阻抗封接，形成全細胞記錄模式。應用膜片鉗放大器記錄電流，2kHz 濾波，采樣頻率為5kHz(Digidata 1320，Axon Instruments)，pCLAMP-8 型軟件進行數據記錄和分析。

1.3 統計學處理 所有統計均采用SPSS13.0軟件在計算機上進行隨機區組設計的單因素方差分析(one-way ANOVA)，各組數據以均數±標準差(±s)表示。

2 結果

2.1 ATP 和Glu 對細胞死亡率的影響 相差顯微鏡顯示正常培養條件下。海馬神經元折光性強，胞體飽滿，有明顯的立體感，周圍有一圈亮暈，神經突起多并延長交織成網狀。采用ATP(100μmol/L)、Glu(100μmol/L)以及ATP+Glu(100μmol/L+100μmol/L)分別處理后，觀察到明顯神經元細胞死亡，細胞形態變圓，突起變短，臺盼藍計數細胞存活率，對照組存活率在90%以上，采用ATP(100μmol/L)、Glu(100μmol/L)以及ATP+Glu(100μmol/L+100μmol/L)分別處理原代培養的海馬神經元24h。單獨給予低劑量ATP 引起大約30%的神經元死亡，單獨給予Glu 引起大約50%的神經元死亡，ATP 和Glu 聯合給予引起接近100% 神經元死亡(P＜0.05)。

2.2 ATP 和Glu 誘導的全細胞電流 在離體培養7d 的海馬神經元上，固定膜電位在－70mV，記錄全細胞電流。低劑量ATP(100μmol/L)誘導的電流很微弱，Glu(100μmol/L)可誘導約300pA 的內向電流(P＜0.05)，ATP(100μmol/L)和Glu(100μmol/L)聯合應用誘導較大的內向電流(P＜0.05)。三者之間的比較，表明ATP 提高了谷氨酸誘導的電流。

2.3 膜外面向外式(outside-out)膜片鉗記錄ATP 和Glu 誘導的離子電流 在全細胞記錄完成后，開始膜片鉗記錄。單獨應用ATP(100μmol/L)沒有誘導明顯的內向電流，單獨應用Glu(100μmol/L)誘導了微弱的內向電流，二者同時使用誘導了較大的內向電流(P＜0.05)，表明ATP 提高了Glu 誘導的內向電流。

3 討論

興奮性毒性是由興奮性神經遞質對受體的過度持續活化導致的神經元死亡過程［8］。20 世紀50 年代Holtol 發現感覺神經興奮時釋放ATP，首次證實了ATP 可以作為神經系統的遞質，提示ATP 在神經興奮傳遞中具有實際意義。ATP 與離子門控型P2X 受體結合可導致細胞膜通透性增加，促使大量Ca2+內流，最終導致靶細胞死亡［2］。谷氨酸作為人腦內含量最高的興奮性氨基酸，當其NMDA 受體過度興奮時大量Ca2+內流，使細胞內Ca2+超負荷，引起Ca2+穩態失調，從而激活依賴于鈣的酶系統引起一系列的細胞損傷。

本實驗通過光學顯微鏡觀察到ATP 及Glu 作用于海馬神經元后，細胞形態變圓，突起變短。臺盼藍計數顯示，ATP(100μmol/L)、Glu(100μmol/L)以及ATP+Glu(100μmol/L+100μmol/L)分別處理后海馬神經元死亡率依次增加，表明ATP 受體通道激活與Glu 對海馬神經元的損傷有協同作用。為進一步探討ATP 與Glu 對海馬神經元的損傷機制，我們應用全細胞電壓鉗放大器，單獨給予ATP 與Glu 或聯合誘導全細胞電流和膜片鉗記錄電流。

實驗結果均表明，單獨給予100μmol/L ATP 沒有明顯的電流產生，可能與使用的ATP 劑量低有關，Skaper 等［2］報道ATP 引起的細胞死亡多為mmol 的劑量，而我們使用的劑量為μmol/L 級的;100μmol/L Glu 可誘導較大的內向電流;二者共同作用增加了電流大小，表明ATP 與Glu 的協同作用。

Domercq 等［9］報道腦缺血損傷是由于ATP 失穩態。腦缺血時ATP 釋放增多，激活P2X7 受體導致顯著的鈣超載，是卒中等缺血性疾病的關鍵。脊髓創傷［10］也與ATP 受體P2X7 激活導致的興奮性毒性有關，應用P2X7 抑制劑可減輕脊髓損傷。

谷氨酸引起的神經元損傷更是被人們所公認作為興奮性神經毒性模型復制的方法［11］。Eftinija等［12］報道體外培養 Schwann 細 胞，給 予 ATP(100μmol/L)引起受體介導的興奮性遞質谷氨酸和天冬氨酸增加，提示在膠質細胞中ATP 可以提高谷氨酸濃度，這與我們在海馬神經元培養中觀察到的ATP 受體通道激活增加谷氨酸對海馬神經元的損傷結果是一致的。但是關于兩種興奮性遞質對神經元的共同作用并未見報道，本實驗結果提示ATP 和Glu 可能同時打開各自的受體通道導致更顯著的鈣超載，從而引起更嚴重的細胞損傷。

探討ATP 和Glu 對神經元的作用，對與興奮毒性有關的紊亂諸如卒中等缺血性疾病、癲癇、阿爾茲海默癥和帕金森病、肌萎縮側索硬化癥等神經退行性疾病的發病機制可能提供重要證據。在這些疾病的發生發展過程中可能存在這兩種受體通道的同時打開，從多個通道進行阻斷可能成為治療這些疾病的新的靶點。

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