慢性心力衰竭大鼠心肌纖維化時血漿內(nèi)皮素-1的動態(tài)變化

謝亞芹，彭玉娟

(承德醫(yī)學(xué)院，河北承德 067000)

隨著人口老齡化，慢性心力衰竭(chronic heart failure，CHF)已成為一個重要的健康和社會問題，但其發(fā)病機制至今尚未完全清楚。近年的研究發(fā)現(xiàn)，細胞因子在CHF的發(fā)病機制中發(fā)揮著重要作用，細胞因子可通過降低心肌收縮力、介導(dǎo)心肌纖維化、促進心肌細胞凋亡等引發(fā)或加重CHF。其中，內(nèi)皮素-1(endothelin，ET-1)可促進心肌細胞和成纖維細胞增殖，從而促進心肌纖維化。本研究采用腎上腹主動脈縮窄術(shù)建立CHF大鼠模型，觀察CHF大鼠心肌纖維化時血漿ET-1的動態(tài)變化，探討其與心肌纖維化發(fā)生發(fā)展的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 動物模型的制備及分組 雄性Wistar大鼠42只，體重250-270g，購于北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，許可證編號:SCXK(京)2006-0009。隨機選取8只大鼠作為假手術(shù)組，其余34只大鼠采用腎上腹主動脈縮窄法建立CHF大鼠模型[1]:3%戊巴比妥鈉(0.15ml/100g)腹腔注射麻醉大鼠，劍突下腹部正中切開皮膚2-3cm，打開腹腔，在左腎動脈上方分離腹主動脈，穿過一條0號絲線，將去尖磨鈍的7號手術(shù)針置于絲線處，結(jié)扎絲線后抽取手術(shù)針，確定腹主動脈通暢后關(guān)腹。假手術(shù)組大鼠僅分離腹主動脈但不做結(jié)扎。術(shù)后均給予青霉素20萬U腹腔注射，連用3d。大鼠術(shù)后飼養(yǎng)4w，隨機抽取10只大鼠檢測血流動力學(xué)參數(shù)，以左室舒張末壓(LVEDP)≥15mmHg作為模型成功的標準[2]。剩余的24只大鼠隨機分為3組(n=8):心衰1d、心衰7d和心衰14d組，大鼠分別于術(shù)后存活1d、7d和14d。

1.2 指標檢測

1.2.1 血流動力學(xué)指標:大鼠稱體重后經(jīng)右頸總動脈逆行插管至左心室，另一端接壓力換能器輸入多媒體生物信號記錄儀系統(tǒng)，記錄左室舒張末壓(LVEDP)和左室內(nèi)壓上升、下降最大速率(±dp/dtmax)。

1.2.2 計算左心室重量指數(shù)(LVMI):大鼠監(jiān)測血流動力學(xué)指標后，迅速開胸取出心臟，冰生理鹽水洗凈，濾紙吸干，沿房室溝剪掉左右心房和主、肺動脈，緊貼室間隔右側(cè)剪下右心室游離壁，剩余部分即為左心室，左心室稱重后，取部分左心室入4%多聚甲醛固定。左心室重量與體重比即為LVMI。

1.2.3 心肌組織病理學(xué)觀察:4%多聚甲醛固定左室心肌常規(guī)石蠟包埋，切片(片厚5μm)，HE染色和Masson染色。Masson染色心肌細胞呈紅色，膠原呈藍色。采用MiVnt圖像分析系統(tǒng)計算心肌膠原容積分數(shù)(collagen volume fraction，CVF)，CVF= 心肌膠原面積/ 視野面積，所有標本均隨機選取4個視野(200×)，取平均值。

1.2.4 血漿ET-1的測定:經(jīng)腹主動脈采血，采用雙抗體夾心ABC-ELISA法檢測ET-1水平，具體操作按ELISA試劑盒(上海博研生物科技有限公司)說明書進行。

1.3 統(tǒng)計分析 采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計處理，數(shù)據(jù)以(±s)表示，多組間比較用采用單因素方差分析，兩兩比較采用q檢驗，α=0.05為顯著性檢驗的標準。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠血流動力學(xué)指標 心衰各組與假手術(shù)組比較，LVEDP明顯升高，±dp/dtmax明顯降低(P＜0.01);且隨著心衰時間的延長，LVEDP逐漸升高、±dp/dtmax逐漸降低，心衰各組間比較有顯著差異(P＜0.01)。表明隨著心衰時間的延長，大鼠心功能逐漸惡化(見表1)。

表1 各組大鼠血流動力學(xué)指標(±s，n=8)

表1 各組大鼠血流動力學(xué)指標(±s，n=8)

與假手術(shù)組比較:aP＜0.01;與心衰1d組比較:bP＜0.01;與心衰7d組比較:cP＜0.01

組別 LVEDP(mmHg)+dp/dtmax(mmHg/s)-dp/dtmax(mmHg/s)假手術(shù)組 6.12±0.91 5544.42±252.66 4860.58±265.82心衰1d組 15.98±1.67a 4652.33±236.87a 3577.24±237.58a心衰7d組 18.61±2.29ab 4348.97±222.58ab 3016.88±152.94ab心衰14d組 21.29±1.55abc 3962.43±132.24abc 2709.16±206.89abc

2.2 各組大鼠的LVMI 與假手術(shù)組比較，心衰各組大鼠的LVMI明顯升高(P＜0.01);且隨著心衰時間的延長，LVMI逐漸升高，心衰各組間比較有顯著差異(P＜0.01，P＜0.05)。見表2。

2.3 各組大鼠心肌病理學(xué)觀察結(jié)果 HE染色:假手術(shù)組大鼠心肌細胞排列整齊，形態(tài)正常，胞漿紋理清晰;隨著心衰時間的延長，逐漸出現(xiàn)心肌細胞肥大，心肌纖維排列紊亂，呈現(xiàn)波浪狀，甚至斷裂。Masson染色:假手術(shù)組大鼠心肌無明顯膠原沉積，隨著心衰時間的延長，心肌膠原沉積逐漸增多。心衰各組與假手術(shù)組比較，CVF明顯升高(P＜0.01);且隨著心衰時間的延長，CVF逐漸升高，心衰各組間比較有顯著差異(P＜0.01，P＜0.05)。見表2。

表2 各組大鼠的LVMI、CVF和血漿ET-1水平(±s，n=8)

表2 各組大鼠的LVMI、CVF和血漿ET-1水平(±s，n=8)

與假手術(shù)組比較:aP＜0.01;與心衰1d組比較:bP＜0.01;與心衰7d組比較:cP＜0.05，dP＜0.01

組別 LVMI(mg/g)CVF(%)ET-1(ng/L)假手術(shù)組 2.11±0.12 7.78±1.30 124.01±11.89心衰1d組 2.55±0.18a 14.57±1.78a 182.55±19.16a心衰7d組 2.89±0.27ab 22.40±2.35ab 219.17±26.55ab心衰14d組 3.18±0.27abc 24.98±2.84abc 292.27±28.64abd

2.4 各組大鼠血漿ET-1水平 與假手術(shù)組比較，心衰各組大鼠血漿ET-1水平明顯升高(P＜0.01);且隨著心衰時間的延長，血漿ET-1水平逐漸升高，心衰各組間比較有顯著差異(P＜0.01)。見表2。

3 討論

CHF為各種心臟疾病的終末期表現(xiàn)，是導(dǎo)致心臟病患者死亡的重要原因。CHF是多種神經(jīng)內(nèi)分泌因子和細胞因子長期、慢性作用的結(jié)果，病理改變的核心是心肌纖維化[3]。心肌纖維化的形成限制心肌活動，降低心室的順應(yīng)性，影響心肌的收縮和舒張功能，促使心功能惡化[4]。因此，如何防治心肌纖維化已成為近年來研究的熱點。本研究采用縮窄腹主動脈的方式復(fù)制慢性心力衰竭模型，通過Masson染色發(fā)現(xiàn)在慢性壓力超負荷心力衰竭中存在明顯的心肌纖維化。

ET-1是機體內(nèi)一種強烈的縮血管物質(zhì)，由血管內(nèi)皮細胞和心肌細胞等分泌產(chǎn)生[5]。ET-1可促進心肌細胞、血管平滑肌細胞等合成和釋放AngⅡ，并可促進心臟成纖維細胞的增殖和膠原的合成[6]。研究發(fā)現(xiàn)，CHF時可伴有ET-1水平的增高[7]。一氧化氮(NO)是一種有效的抗心肌纖維化因子，NO合成或分泌不足可促使AngⅡ誘發(fā)心肌纖維化。ET和NO在心肌纖維化中的作用相互拮抗，ET-1通過與受體結(jié)合調(diào)節(jié)NOS的活性和NO的產(chǎn)生，而NO可通過cGMP在多種水平對抗ET- 1的有害效應(yīng)，維持正常的心血管功能[8]。在正常生理狀態(tài)下二者處于動態(tài)平衡，一旦平衡被打破，將導(dǎo)致血流動力學(xué)改變，造成心功能惡化，從而導(dǎo)致心力衰竭。

本研究發(fā)現(xiàn)，在壓力負荷下形成CHF的過程中伴有血漿ET-1水平的顯著升高，并且隨著心衰時間的延長及心肌纖維化程度的增加而逐漸增高。提示ET-1可能參與了心肌纖維化的形成過程。因此提示，通過藥物抑制ET-1的過度表達及活性來抑制心肌纖維化的發(fā)展可能為防治心肌纖維化提供新思路。

[1]李昌繁，江時森.心力衰竭動物模型的研究進展[J].醫(yī)學(xué)研究生學(xué)報，2007，20(5):532-534.

[2]程勁松，趙玉蘭，楊樹涵，等.坎地沙坦抑制慢性心衰大鼠心肌纖維化并降低心肌轉(zhuǎn)化生長因子β1、結(jié)締組織生長因子表達[J].中國藥學(xué)雜志，2009，44(11):832-835.

[3]Chen KH, Guo X, Ma D, et al.Dysregulation of HSG triggers vascular proliferative disorders[J].Nat Cell Biol,2004,6(9):807-808.

[4]Takeda N, Manabe I, Uchino Y.Cardiac fibroblasts are essential for the adaptive response of the murine heart to pressure overload[J].J Clin Invest,2010,120(1):254-265.

[5]鄭婧，任利群.內(nèi)皮素-1在充血性心力衰竭發(fā)生發(fā)展中的作用[J].醫(yī)學(xué)綜述，2010，16(20): 3133-3135.

[6]Piacentini L, Gray M, Honbo NY, et al.Endothelin-1 stimulates cardiac fibroblast proliferation through activation of protein kinase C[J].J Mol Cell Cardiol, 2000,32(4):565-576.

[7]Ohmae M.Endothelin-1 levels in chronic congestive heart failure[J].Wien Klin Wochenschr, 2011, 123(23-24): 714-717.

[8]Tomic M, Galesic K, Markota I.Endothelin- 1 and nitric oxide in patients on chronic hemodialysis[J].Ren Fail,2008,30(9):836-842.