丙戊酸鈉對RPMI8226細(xì)胞增殖的影響*

喬 蓮，張志華，王陶然，王麗紅，郝長來

(承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院血液病科，河北承德 067000)

多發(fā)性骨髓瘤(multiple myeloma，MM)是以漿細(xì)胞惡性克隆性增殖為主要特征的血液系統(tǒng)惡性腫瘤，好發(fā)于中老年人，近年來發(fā)病率有逐漸增高的趨勢，目前的主要治療措施是聯(lián)合化療與造血干細(xì)胞移植，但無法完全治愈。組蛋白去乙酰化酶抑制劑(histone deacetylase inhibitors，HDACI)能在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中通過改變DNA或染色質(zhì)的結(jié)構(gòu)性組分，調(diào)節(jié)腫瘤抑制因子的表達(dá)和轉(zhuǎn)錄因子的激活[1]。HDACI作為新型的抗腫瘤藥物，能夠顯著抑制腫瘤細(xì)胞的增殖，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞分化并誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，可對腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生廣泛的影響。丙戊酸鈉(valproic acid，VPA)是一種耐受性良好的抗癲癇藥，同時也作為HDAC抑制劑具有抗腫瘤的作用。近年的研究證實，VPA對MM細(xì)胞具有體外抗增殖及誘導(dǎo)凋亡作用[2]。本研究以人多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞株RPMI8226細(xì)胞為研究對象，觀察VPA對RPMI8226細(xì)胞增殖的影響，并對相關(guān)作用機制進(jìn)行初步探討。

1 材料與方法

1.1 材料和試劑 人多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞株RPMI8226，購自上海中美合資博慧斯生物醫(yī)藥科技有限公司。VPA，美國Sigma公司，用滅菌注射用水稀釋，-20℃冰箱密閉避光保存，臨用前用不含血清和抗生素的RPMI 1640液稀釋至所需濃度。MTT試劑，石家莊市勃盛化學(xué)試劑有限公司(配制方法:稱取MTT粉劑250mg，溶于50ml的PBS液中，于電磁力攪拌機上攪拌30min溶解后，用0.22μm的微孔濾膜過濾除菌分裝，-20℃避光保存。)。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) RPMI8226細(xì)胞培養(yǎng)于含15%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基中，同時加入青霉素(100U/ml)和鏈霉素(100U/ml)，37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng);每2-3d換液傳代1次，取對數(shù)生長期細(xì)胞用于實驗。

1.3 MTT法檢測RPMI8226細(xì)胞的增殖情況 取對數(shù)生長期RPMI8226細(xì)胞，800r/min離心5min收集細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為5×104個/ml，接種于96孔培養(yǎng)板。實驗組分別加入不同濃度的VPA(0.5、1.0、2.0、4.0mmol/L)，對照組不加藥，每個藥物濃度設(shè)3個復(fù)孔。各組細(xì)胞于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)分別培養(yǎng)24h、48h、72h后，每孔加入MTT溶液(5mg/ml)10μl;繼續(xù)培養(yǎng)4h后，加入三聯(lián)液(10% SDS-5%異丁醇-0.012 mol/L HCL)，100μl/孔，于37℃放置過夜后，應(yīng)用酶標(biāo)儀檢測各孔490nm處的吸光度(A)值。以該組復(fù)孔的平均值作為該組細(xì)胞的A值，計算細(xì)胞生長抑制率:細(xì)胞生長抑制率(%)=(1-實驗組A值/對照組A值)×100%，實驗重復(fù)3次。

1.4 統(tǒng)計分析 采用SPSS 17.0統(tǒng)計學(xué)軟件處理數(shù)據(jù)，組間比較行單因素方差方析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

不同濃度VPA對RPMI8226細(xì)胞的增殖抑制作用:同一時間點，不同濃度VPA處理RPMI8226細(xì)胞后，各處理組與對照組相比，細(xì)胞增殖均受到抑制(P＜0.05)，且隨著VPA處理濃度的增加，細(xì)胞增殖抑制率逐漸升高(P＜0.05)。同一濃度VPA作用下，隨著作用時間的延長，細(xì)胞增殖抑制率亦逐漸升高(P＜0.05)。見附表。

附表 不同濃度VPA對RPMI8226細(xì)胞的增殖抑制作用(±s)

附表 不同濃度VPA對RPMI8226細(xì)胞的增殖抑制作用(±s)

與對照組同時間點比較:aP＜0.05;同時間點VPA各濃度間比較:bP＜0.05;同一VPA濃度不同時間點間比較:cP＜0.05

VPA(mmol/L) 抑制率(%)24h 48h 72h對照組 0 0 0 0.5 2.96±2.53abc 10.31±3.63abc 38.42±1.78abc 1 7.66±3.09abc 16.76±5.03abc 47.67±2.16abc 2 13.65±4.85abc 21.91±6.21abc 52.62±1.95abc 4 21.92±3.08abc 30.42±3.83abc 58.52±1.29abc

3 討論

多發(fā)性骨髓瘤(MM)是來源于終末分化B淋巴細(xì)胞的惡性腫瘤，特征是骨髓中漿細(xì)胞克隆性增生，合成并分泌大量免疫球蛋白。多發(fā)性骨髓瘤占造血系統(tǒng)腫瘤的10%，占全部惡性腫瘤的1%[3]。由于傳統(tǒng)的常規(guī)化療緩解率低及多藥耐藥的形成，目前多發(fā)性骨髓瘤的臨床治療仍十分困難，尋找新的靶向治療藥物成為當(dāng)今的研究熱點。

組蛋白去乙酰化酶抑制劑(HDACI)是以組蛋白乙酰化修飾為作用靶點的新的抗血液腫瘤藥物，很多研究顯示，HDACI能夠通過誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和分化、促使細(xì)胞周期停滯而抑制血液腫瘤細(xì)胞增殖[4-5]。近年的研究表明，耐受性良好的抗癲癇藥物VPA是一種強有力的HDAC抑制劑，VPA能夠解除HDAC依賴性轉(zhuǎn)錄抑制，并能在體內(nèi)、體外引起組蛋白的高乙酰化[6]。

已有研究顯示，VPA可通過抑制HDAC的作用，使核小體組蛋白乙酰化，逆轉(zhuǎn)HDAC參與的異常基因表達(dá)，從而有效抑制腫瘤細(xì)胞增殖;并且VPA可以選擇性地作用于腫瘤細(xì)胞，而對正常細(xì)胞無毒性，因此，由于VPA較好的生物利用度和低毒副作用而備受關(guān)注[7]。本研究發(fā)現(xiàn)，不同濃度的VPA均能有效抑制RPMI8266細(xì)胞增殖，這與前人的研究結(jié)果一致，VPA在體內(nèi)和體外均能抑制多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)其凋亡[8-9]。有研究表明，VPA能誘導(dǎo)乙酰化組蛋白的積聚，并能有效的以劑量依賴性方式抑制骨髓瘤細(xì)胞的增殖并誘導(dǎo)其凋亡[10]。本研究也證實了這一點:本研究中，隨著VPA濃度的增加及作用時間的延長，對RPMI8226細(xì)胞的增殖抑制率逐漸升高。

本研究表明，VPA具有抑制骨髓瘤細(xì)胞系RPMI8226細(xì)胞增殖的作用，為VPA作為HDAC抑制劑治療多發(fā)性骨髓瘤提供了實驗依據(jù)。

[1]Tan J, Cang S, Ma Y, et al.Novel histone deacetylase inhibitors in clinical trials as anti-cancer agents[J].J Hematol Oncol, 2010, 3:5.

[2]Neri P, Tagliaferri P, Di Martino MT, et al.In vivo anti-myeloma activity and modulation of gene expression profile induced by valproic acid, a histone deacetylase inhibitor[J].Br J Haematol,2008, 143(4): 520-531.

[3]原瑩瑩，曾志勇，陳君敏.DAPT對骨髓瘤細(xì)胞RPMI8226增殖和凋亡的影響[J].中國實驗血液學(xué)雜志，2012，20(4):922-925.

[4]Carey N, La Thangue NB.Histone deacetylase inhibitors:gathering pace[J].Curr Opin Pharmacol, 2006, 6(4): 369-375.

[5]Mitsiades CS, Mitsiades NS, McMullan CJ, et al.Transcriptional signature of histone deacetylase inhibition in multiple myeloma:biological and clinical implications[J].Proc Natl Acad Sci U S A,2004, 101(2): 540-545.

[6]G?ttlicher M, Minucci S, Zhu P, et al.Valproic acid defines a novel class of HDAC inhibitors inducing differentiation of transformed cells[J].EMBO J, 2001, 20(24):6969-6978.

[7]Huang X, Guo B.Adenomatous polyposis coli determines sensitivity to histone deacetylase inhibitor-induced apoptosis in colon cancer cells[J].Cancer Res, 2006, 66(18): 9245-9251.

[8]朱藝芳，葉寶國，沈建箴，等.丙戊酸鈉抑制人多發(fā)性骨髓瘤U266細(xì)胞增殖及組蛋白乙酰化調(diào)控的研究[J].中國實驗血液學(xué)雜志，2010，18(3):638-641.

[9]Schwartz C, Palissot V, Aouali N, et al.Valproic acid induces non-apoptotic cell death mechanisms in multiple myeloma cell lines[J].Int J Oncol, 2007, 30(3): 573-582.

[10]Kaiser M, Zavrski I, Sterz J, et al.The effects of the histone deacetylase inhibitor valproic acid on cell cycle,growth suppression and apoptosis in multiple myeloma[J].Haematologica, 2006, 91(2): 248-251.