去鐵胺對帕金森SHSY5Y細胞的保護作用

[摘要] 目的 探討鐵螯合劑去鐵胺對MPP+誘導的帕金森病細胞模型的保護作用。 方法 培養SHSY5Y細胞，去鐵胺預處理或未處理1 h，再給予MPP+48 h。利用MTT法檢測細胞活力，Western blotting法檢測CHOP和Caspase-12的表達，利用ROS特異性染料H2DCF-DA標記胞內ROS。 結果 SHSY5Y細胞給予MPP+后細胞活力顯著下降，內質網應激相關蛋白CHOP和Caspase-12的表達增加。表明去鐵胺預處理后顯著減輕MPP+所致的細胞損傷，同時降低內質網應激相關蛋白CHOP和Caspase-12的表達，并且去鐵胺能夠抑制ROS生成。 結論 去鐵胺對MPP+制備的帕金森SHSY5Y細胞具有保護作用，與其抑制內質網應激作用相關。

[關鍵詞] 去鐵胺；SHSY5Y細胞；內質網；帕金森病

[中圖分類號] R742.5 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-9701（2013）03-0007-03

帕金森病（Parkinson’s disease，PD）是第二大常見的中樞神經系統退行性疾病，主要的病理變化是中腦黑質多巴胺能神經元進行性丟失和富含α-synuclein蛋白的路易氏小體沉積[1]。目前PD的發病機理主要包括氧化應激、興奮性毒性、線粒體損傷和神經炎癥等假說[2]，但并不知道PD確切的發病機制。研究發現無論是在PD患者還是動物模型中，中腦鐵沉積都顯著增加。鐵可以通過Fenton反應促進自由基的生成，對神經元造成氧化損傷，最終導致神經元的死亡[3]。目前已報道鐵螯合劑去鐵胺對6-OHDA制備的大鼠PD模型具有保護作用[4]。但是在PD中并未有其與內質網應激關系的報道。

1 材料與方法

1.1 SHSY5Y細胞培養與給藥

SHSY5Y細胞用含有10%胎牛血清的DMEM，置于37℃ 5%CO2的細胞培養箱中培養。給藥：預先給予或不給予去鐵胺（Sigma）1 h，再給予MPP+（400 μM，Sigma）48 h后進行實驗。

1.2 MTT測定

將細胞種在96孔板中，藥物處理完畢后，棄培養液，加入含有MTT（0.5 mg/mL）的DMEM，置于細胞培養箱中孵育4 h。棄上清，加入200 μL DMSO溶解，利用酶標儀（Vario Skan Flash，3001，Thermo Scientific）在290 nm處讀取吸光度。該實驗分別獨立進行四次，結果以對照組作為參照（設為100%）。

1.3 LDH測定

經藥物處理完畢后，搜集細胞上清，利用LDH檢測試劑盒（建成生物）測定細胞LDH釋放量，按照說明書進行操作。利用酶標儀（Vario Skan Flash， 3001， Thermo Scientific） 在490 nm處讀取吸光度。該實驗分別獨立進行四次，結果以對照組作為參照（設為100%）。

1.4 Western blotting

細胞種于六孔板中，藥物處理完畢后，吸棄培養液，置于冰上。加入冰D-Hank’s液洗滌兩遍，再加入Rippa蛋白裂解液冰上裂解45 min。用細胞刮刮下細胞，轉至EP管，12 000 rpm，4 ℃離心25 min。取上清，加入5×上樣緩沖液，沸水煮5 min。通過BCA（碧云天）蛋白定量法確定蛋白濃度。以100 μg蛋白量上樣于12% SDS-PAGE進行凝膠電泳，4℃ 300 mA電轉90 min。5% BSA-TBST封閉1 h后，加入兔抗GRP78抗體（1∶1 000，Cell signaling Technology），小鼠抗CHOP抗體（1∶1 000，Cell signaling Technology），兔抗Caspase-12抗體（1∶1 000，Cell signaling Technology），小鼠抗β-actin抗體（1∶1 000，博士德）4 ℃過夜。TBST漂洗10 min×3次后，加入HRP標記的二抗羊抗小鼠-HRP二抗，羊抗兔-HRP二抗（1∶800，北京中杉）室溫孵育1 h后加入ECL（Pierce）發光底物顯色。Omega 16IC全自動化學發光凝膠成像系統顯影分析。利用Imagine J分析條帶光密度值。

1.5 胞內ROS含量測定

利用ROS特異性染料H2DCF-DA標記胞內ROS。藥物處理完畢后，加入25μM的H2DCF-DA孵育30 min。孵育完畢后，用冰PBS洗滌3遍，最后用酶標儀在530 nm和485 nm雙波長讀取吸光度。該實驗分別獨立進行四次，結果以對照組作為參照（設為100%）。

1.6 統計學方法

所有數據均采用（x±s）表示，采用SPSS 16.0統計軟件對數據進行錄入與分析，應用t檢驗進行統計學分析。P <0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 去鐵胺對細胞活力的影響

SHSY5Y細胞給予400 μM MPP+后，細胞活力顯著下降，較對照組下降約33%（表1，P < 0.001）。分別預先給予25 μM、50 μM和100 μM去鐵胺1 h，結果顯示，25 μM去鐵胺對MPP+引起的細胞損傷無保護作用，但50 μM和100 μM去鐵胺對MPP+引起的細胞損傷均具有保護作用（表1，P < 0.01）。同時我們測定了細胞培養基中LDH，結果顯示，MPP+刺激后顯著誘導細胞LDH釋放（表1，P < 0.01）。分別添加25 μM、50 μM和100 μM去鐵胺預處理1 h，發現25 μM去鐵胺對MPP+引起的LDH釋放無抑制作用，但50 μM和100 μM去鐵胺均能抑制MPP+引起的細胞LDH釋放（表1，P < 0.01），表明去鐵胺能減輕MPP+誘導的細胞損傷。因此，我們選擇50 μM進行后續試驗。

2.2 去鐵胺對內質網應激的影響

Western blotting結果顯示，SHSY5Y細胞給予400 μM MPP+后，內質網應激相關蛋白Caspase-12和CHOP表達顯著增加（圖1，P < 0.01）。當預先給予50 μM去鐵胺后能夠顯著抑制Caspase-12和CHOP的表達（圖1，P < 0.05），表明去鐵胺能夠抑制MPP+引起的內質網應激。

2.3 去鐵胺對ROS的影響

見表2。

表2 ROS測定結果（以對照組為100%）（x±s）

注：與對照組比較，**P < 0.01；與MPP+組比較，#P < 0.05；去鐵胺濃度為50 μM

3 討論

近年來內質網應激作為PD新的發病機制已經進入人們的視野。內質網作為細胞內蛋白質合成的主要場所，負責蛋白質正確的加工折疊。而α-synuclein是與PD密切相關的蛋白，在病理情況下發生異常折疊積聚，引起內質網應激。本文通過制備PD細胞模型，研究發現鐵螯合劑去鐵胺能減輕MPP+導致的細胞損傷，并且這一作用可能是通過抑制內質網應激發揮的。

PD是常見的神經系統退行性疾病，表現為多巴胺能神經元進行性丟失。盡管目前有很多關于PD病理機制的假說，但我們并不知道其確切的發病機制。近年來內質網應激在PD研究中逐漸受到重視。內質網是細胞蛋白質合成的主要場所，負責蛋白質正確的組裝與折疊，當蛋白質異常折疊時能夠引發錯誤折疊蛋白反應（unfolded protein response，UPS）。UPS主要由位于內質網上的三個敏感蛋白激發：PERK，通過磷酸化eIF2a廣泛抑制蛋白質的翻譯；IRE-1，剪切轉錄因子XBP1的mRNA，促進XBP1表達，進而上調伴侶分子基因的表達；ATF-6，位于內質網膜上的轉錄因子，在UPS中發生核轉位，促伴侶分子表達。UPS的目的是維持內質網的穩定，停止蛋白質的合成，促進蛋白質降解，增加伴侶分子表達，促進蛋白質的正確折疊，但是當UPS持續存在是能夠啟動凋亡通路[5]。α-synuclein是PD中重要的病理蛋白，在PD的患者和動物模型中均發現了α-synuclein的異常積聚。已經有研究表明異常折疊的α-synuclein能夠激發內質網應激，并且激活CHOP和Caspase-12，促進Caspase-12剪切，最終激活Caspase-3造成神經元凋亡[6-8]。

PD中另一個表現是中腦黑質區鐵沉積增加，目前這一現象的機制并不明了[9]。但是過多的鐵能夠發生Fenton反應，促進自由基生成，引起氧化應激，造成神經元損傷[10]。現在已有鐵螯合劑去鐵胺對PD動物模型的報道，但是尚未有去鐵胺對內質網應激影響的報道。我們發現去鐵胺能抑制MPP+引起的內質網應激，同時我還發現去鐵胺能抑制MPP+誘導的ROS生成，SHSY5Y細胞經MPP+孵育48 h后ROS生成顯著增加，是對照組的1.5倍左右（表2，P < 0.01）。而預先給予50 μM的去鐵胺后能顯著抑制MPP+誘導的ROS生成（表2，P < 0.05），這些可能都是去鐵胺發揮保護多巴胺能神經元的作用機制。

本研究表明鐵螯合劑去鐵胺能抑制內質網應激和ROS產生發揮對多巴胺能神經元的保護作用，揭示了其新的作用機制。

[參考文獻]

[1] Lees AJ，Hardy J，Revesz T. Parkinson's disease[J]. Lancet，2009，373（9680）：2055-2066.

[2] Schapira AH，Jenner P. Etiology and pathogenesis of Parkinson's disease[J]. Mov Disord，2011，26（6）：1049-1055.

[3] Lee HP，Zhu X，Liu G，et al. Divalent metal transporter， iron，and Parkinson's disease：a pathological relationship[J]. Cell Res，2010，20（4）：397-399.

[4] Ben-Shachar D，Eshel G，Finberg JP，et al. The iron chelator desferrioxamine（Desferal） retards 6-hydroxydopamine-induced degeneration of nigrostriatal dopamine neurons[J]. J Neurochem，1991，56（4）：1441-1444.

[5] Hotamisligil GS. Endoplasmic reticulum stress and the inflammatory basis of metabolic disease[J]. Cell，2010，140（6）：900-917.

[6] Bernales S，Soto MM，McCullagh E. Unfolded protein stress in the endoplasmic reticulum and mitochondria：a role in neurodegeneration[J]. Front Aging Neurosci，2012，4：5.

[7] Hoozemans JJ，Scheper W. Endoplasmic reticulum：The unfolded protein response is tangled in neurodegeneration[J]. Int J Biochem Cell Biol，2012，44（8）：1295-1298.

[8] 潘鳳英，賈國強，巴曉紅. 內質網應激與帕金森病的研究進展[J]. 臨床神經病學雜志，2011，24（1）：78-79.

[9] 姜宏，陳文芳，謝俊霞. 帕金森病模型大鼠腦內多巴胺與鐵含量的關系[J]. 生理學報，2001，53（5）：329-333.

[10] Mattson MP. Nitro-PDI incites toxic waste accumulation[J]. Nat Neurosci，2006，9（7）：865-867.

（收稿日期：2012-09-17）