大麻素受體1在大鼠非酒精性脂肪性肝病的實驗研究

[摘要] 目的 觀察大麻素受體1（CB1R）在大鼠非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）模型中的表達情況，并使用CB1R拮抗劑利莫那般評價對NAFLD的治療作用，探究其可能機制。方法 采用高糖高脂飼料（HSHF）建立大鼠NAFLD模型，分組并連續(xù)給藥8周，取動物血清和肝臟，通過免疫組織化學染色方法檢測肝組織CB1R在實驗組的表達情況，通過蘇木素-伊紅染色（HE）、酶聯(lián)免疫吸附實驗（ELISA）、血清生化檢測，觀察利莫那般對肝臟組織病理學、肝功能酶學、血脂等的影響。 結果 CB1R在模型組的表達與對照組、干預組比較顯著增加（P <0.01），利莫那般可逆轉肝組織脂肪變性，降低血清leptin、TNF-α、丙氨酸氨基轉氨酶（ALT）、天門冬氨酸氨基轉移酶（AST）、甘油三酯（TG）、總膽固醇（TC）的含量，與模型組比較，差異有統(tǒng)計學意義（P < 0.01）。 結論 采用HSHF飼料喂養(yǎng)大鼠30 d成功建立NAFLD模型，CB1R拮抗劑有望成為NAFLD治療的潛在靶點。

[關鍵詞] 非酒精性脂肪肝；大麻素受體1；利莫那般

[中圖分類號] R575.5 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-9701（2013）03-0025-03

NAFLD是一種無過量飲酒史、病理組織學表現(xiàn)為肝實質細胞脂肪變性和炎癥浸潤為特征的臨床病理綜合征，與肥胖、胰島素抵抗、脂代謝紊亂等密切相關。內源性大麻素物質是一類由酰胺、酯類和長鏈不飽和脂肪酸組成的新脂質介質，他們能激活特異的大麻素受體，即CB1和CB2[1]。參與機體代謝的調節(jié)，正是由于CB1對脂代謝的影響提示，CB1R及其受體拮抗劑的研究可能為脂肪肝的治療提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物及飼料 普通級雄性SD大鼠（山西醫(yī)科大學實驗動物中心提供）42只，鼠齡約6～8 w，體重180～220 g。HSHF配方如下[2]：標準普通飼料（Standard Chow，簡寫SC）72.8%、豬油10%、膽固醇2%、蛋黃粉5%、丙基硫氧嘧啶0.2%、蔗糖10%。

1.1.2 藥品和試劑 利莫那般購自濟南偉都化工有限公司。ALT、AST、TG、TC試劑盒購自南京建成生物工程研究所。Leptin、TNF-α試劑盒購自上海西塘生物科技有限公司。CB1抗體購自博士德生物工程有限公司。

1.2 方法

1.2.1 動物分組 適應性飼養(yǎng)1 w后，完全隨機分組。對照組12只，予SC喂養(yǎng)至12 w，4 w、12 w分別處理6只；模型1組12只，予HSHF至12 w，4 w、12 w分別處理6只；模型2組6只，予HSHF喂養(yǎng)4 w后，予SC喂養(yǎng)至12 w；干預1組6只，予HSHF喂養(yǎng)4 w后，予HSHF+利莫那般20 mg/（kg·day）腹腔注射至12 w；干預2組6只，予HSHF喂養(yǎng)4 w后，予SC+利莫那般20 mg/（kg·day）腹腔注射至12 w。

1.2.2 血生化指標檢測 嚴格按說明書測定血清中TG、TC、ALT、AST的含量及活性。

1.2.3 ELISA檢測 按照ELISA試劑盒檢測Leptin、TNF-α含量，結果用ELISA軟件統(tǒng)計處理。

1.2.4 病理學檢查 大鼠肝臟組織標本以10%中性福爾馬林液固定，浸蠟包埋切片，經(jīng)乙醇梯度脫水進行常規(guī)HE染色，光學顯微鏡下觀察。

1.3 統(tǒng)計學分析

采用 SPSS16.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)處理，計量資料以x±s表示。兩組比較采用t檢驗，同一指標的組間比較采用方差分析，以P < 0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1造模

模型1組4 w大鼠攝食高糖高脂肪飼料30 d，肝臟體積增大，外觀呈局灶性奶白色變性灶，對照組4 w大鼠肝臟大小正常；血清中TG、TC、ALT、AST顯著升高（P < 0.05），見表1；肝臟病理組織學顯示肝細胞胞質中充滿大小不等的圓形脂肪空泡，主要為彌漫性大泡性脂肪變性，證明NAFLD模型建立成功。 見圖1。

表1 造模30 d大鼠血清生化指標的比較（x±s，n = 6）

注：△與對照組4 w比較具有統(tǒng)計學意義（P < 0.05）

圖1 大鼠肝臟HE染色結果（肝組織HE染色×250）

2.2 肝組織CB1R免疫組織化學染色表達

CB1R主要在胞漿內著色，平均灰度值與其表達成反比。對照組12 w中CB1R在上皮細胞和肝細胞低表達；高脂飲食誘導CB1R主要表達在肝細胞和門靜脈周圍，與對照組12 w比較，模型1組12wCB1R表達明顯增加（P < 0.01）；加入CB1R拮抗劑后，與對照組12 w和模型1組12 w比較，干預1組CB1R表達明顯降低（P < 0.01）。見表2。

2.3 CB1R表達、leption和TNF-α的相關性分析

高脂飲食誘導肝臟表達CB1R上調，模型1組CB1R的表達情況與leptin、TNF-α呈明顯正相關，各相關系數(shù)分別為：與leptin（r = 0.619，P < 0.05），與TNF-α（r = 0.615，P < 0.05）。

2.4 CB1受體拮抗劑對大鼠NAFLD的作用

2.4.1 組織病理學觀察 模型1組12 w肝細胞仍有空泡樣變，部分肝小葉和匯管區(qū)可見以單核細胞為主的炎性細胞浸潤；模型2組可見小泡性脂肪變性；干預組肝細胞索結構尚可，脂肪滴減少，肝細胞脂變情況和炎癥程度均有明顯改善。 見圖1。

2.4.2 測量指標觀察 體重：模型1組12 w、模型2組大鼠體重顯著高于對照組12 w（P < 0.01）；干預1、2組大鼠給藥后體重迅速下降，明顯低于模型1組12 w、模型2組，但仍高于對照組12 w（P < 0.01）。肝重：模型1組12 w、模型2組肝重顯著高于對照組12 w（P < 0.01）；干預1組、干預2組肝重低于同期對照組（P < 0.01），干預2組肝重低于模型2組（P < 0.01）。血清leptin、TNF-α：模型1組12 w、模型2組大鼠血清leptin、TNF-α較于同期對照組明顯升高，干預1組較于模型1組12 w，血清leptin、TNF-α明顯減低（P < 0.01）。血清生化指標：與對照組12 w比較，模型1組12 w中ALT、AST、TG、TC含量顯著升高（P < 0.01）；與模型1組12 w比較，干預1組ATL、AST、TC明顯降低（P < 0.01）；與模型2組比較，干預2組ALT、AST顯著降低（P < 0.01）。見表3，4。

3 討論

3.1 動物模型的建立

目前脂肪肝的動物模型建立方法以高脂飼料誘導法最常用，但此法不太符合現(xiàn)代人“高糖+高脂”的飲食結構。胡克章、楊坤[2]等人采用高糖高脂肪飼料喂養(yǎng)SD大鼠30 d，成功建立以重度脂肪肝為主的NAFLD模型，且停止造模后30 d該模型基本穩(wěn)定，因此本實驗研究遵循現(xiàn)代人類的飲食習慣，采用上述方法建立NAFLD動物模型。

3.2 CB1受體

CB1R存在于體內多種細胞表面，包括下丘腦、肝細胞、肌肉組織等。在肝臟，高脂飲食誘導CB1R，進而激活肝臟脂肪合成基因主要轉錄因子（SREBP-1c）及其靶酶乙酰Co羧化酶（ACC-1）和脂肪酸合成酶（FAS），促進脂肪酸的合成；同時抑制脂肪β-氧化靶酶肉堿棕櫚酰轉移酶（CPT-1）活性，減少脂肪β-氧化，體內甘油三脂增加，致使肥胖和脂肪肝[3]。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)，高脂飲食刺激下丘腦以及邊緣系統(tǒng)產(chǎn)生更多的AEA和CB1R，CB1受體增加SREBP-1c和FAS，F(xiàn)AS的增加促進食欲[4]。而加入利莫那般后，同時抑制上述兩條途徑，作用于下丘腦短暫地抑制食欲，作用于肝臟，增強線粒體的功能，增加脂肪氧化和能量的消耗，本實驗中利莫那般干預組大鼠攝食量明顯減少，體重緩慢減少。

3.3 CB1受體與NAFLD

CB1R參與脂質代謝，與肥胖、糖尿病等代謝綜合征密切相關。而NAFLD是代謝綜合征和胰島素抵抗在肝臟表現(xiàn)。目前普遍認為胰島素抵抗是發(fā)病的關鍵環(huán)節(jié)，而脂肪因子在誘導和加重胰島素抵抗中發(fā)揮著重要作用。TNF-α是造成肝細胞損傷的主要因子，可促進中性粒細胞浸潤，加重炎癥反應，導致細胞死亡[5]。同時，高濃度的TNF-α可減少外周組織脂肪分解，促進肝細胞TG的合成與聚集，加快脂肪肝的形成。楊盈盈[6]等人探究TNF-α和大麻素的關系發(fā)現(xiàn)，內毒素刺激巨噬細胞產(chǎn)生TNF-α，TNF-α通過NF-kB信號通路激活大麻素系統(tǒng)，進而加重細胞β-氧化。而Jourdan[7]的研究表明，CB1R能增加脂肪組織表達TNF-α。本實驗中，模型1組大鼠CB1R表達與血清中TNF-α含量明顯正相關，而且利莫那般干預后，相較于模型1組12 w，TNF-α明顯降低，我們推斷CB1R可能主要是通過降低血清TNF-α從而在NAFLD的發(fā)病機制中也扮演重要角色。另一個脂肪細胞因子瘦素，ChitturiS[8]等人報道血清瘦素水平直接與肝脂肪變的程度相關，并且其含量在NAFLD患者明顯升高，而理論上瘦素能增加脂肪分解，減少合成，可見瘦素與肝脂肪變性的關系可能反映瘦素在肝性胰島素抵抗中的作用，即外周瘦素抵抗。本實驗中，利莫那般干預后瘦素水平下降，肝脂肪變性程度減弱，可推斷肝臟CB1R致使瘦素抵抗，其拮抗劑改善瘦素抵抗。可見，CB1R和脂肪因子相互關聯(lián)、相互影響共同參與NAFLD的發(fā)病環(huán)節(jié)，但是通過何種機制和途徑實現(xiàn)的，是否與上述學者的研究有共通之處還需進一步地研究證實。

3.4利莫那般

近年來NAFLD發(fā)病率逐年增高，但目前對該病的干預僅僅是改善飲食和生活方式。考慮藥物本身抑制食欲，我們分別設計了高脂飲食和普通飲食下藥物的作用。實驗結果提示干預組大鼠體重較于相應對照組和模型組有明顯減輕，肝臟病理HE表明利莫那般可逆轉肝組織脂肪變性，而普通飲食可減輕脂肪變性程度；藥物能減少血清中l(wèi)eptin和 TNF-α，改善瘦素抵抗，阻止炎癥因子作用，進一步阻止NAFLD向纖維化方向進展；生化指標中，ALT、AST在干預組中明顯下降，與相應模型組比較有統(tǒng)計學意義，但TG在相應干預組和模型組中比較沒有統(tǒng)計學意義，TC在干預2組和模型2組比較沒有統(tǒng)計學意義，這可能與動物例數(shù)、藥物治療的療程和劑量有關，有待更多的實驗研究。

[參考文獻]

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[2] 胡克章，楊坤，黃正明. 高糖高脂肪飼料誘導大鼠非酒精性脂肪肝的實驗研究[J]. 解放軍藥學學報，2009，25（2）：136-138.

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[7] Jourdan T. CB1 antagonism exerts specific molecular effects on visceral and subcutaneous fat and reverses liver steatosis in diet-induced obese mice[J]. Diabetes，2010，59：926-934.

[8] Chitturi S，F(xiàn)arrell G，F(xiàn)rost L，et al. Serum leptin in NASH correlates with hepatic steatosis but not fribrosis：a manifestation of lipotoxicity[J].Hepatology，2002，36（2）：403-409.

（收稿日期：2012-11-20）