小鼠卵裂球胞質(zhì)核移植后的重編程

摘要:眾所周知，卵細(xì)胞通過(guò)核移植對(duì)已分化的供體核重編程克隆動(dòng)物。近年來(lái)研究表明，受精卵仍有重編程能力，卵裂期也可能存在。采用核移植技術(shù)研究2-cell胚胎卵裂球胞質(zhì)是否能對(duì)已分化的供體核重編程。將胚胎細(xì)胞或CD4+T淋巴細(xì)胞作為供體核，替換2-cell其中一個(gè)胞質(zhì)的核，觀察發(fā)育胚泡的重編程能力。該方法所得的胚胎可用于建立胚胎干細(xì)胞系，也可發(fā)育為嵌合體“克隆動(dòng)物”。結(jié)果表明胞質(zhì)仍能重編程，且分離人類植入前的胚胎可作為遺傳學(xué)上特定胚胎干細(xì)胞系的有效受體這一理論也得到了支持。

結(jié)果與討論

經(jīng)核移植的重編程可通過(guò)動(dòng)物或體細(xì)胞ES傳給后代。此方法一旦成功用于人類，就能為特殊藥物的個(gè)別患者或體外建立人類干細(xì)胞系。然而遠(yuǎn)不成功，由于人類胚胎的活力有限。

該重編程只在特定條件下才能成功，使供體細(xì)胞的獲得很難。重編程和胚胎發(fā)育在細(xì)胞中期核移植至卵母細(xì)胞或受精卵后發(fā)生，而間期不行。在間期無(wú)重編程能力，尤其將ICM移入間期2-cell。

重編程成功的關(guān)鍵是中期去除受體核，此時(shí)核膜消失且染色體處于皺縮狀態(tài)。這說(shuō)明，除胚胎或受精卵外，重編程也可能發(fā)生于其他細(xì)胞類型，當(dāng)且僅當(dāng)在有絲分裂期去核。因胚胎細(xì)胞相對(duì)較大，2-cell胞質(zhì)是否能重編程是關(guān)鍵。

胞質(zhì)是否能重編程，需穩(wěn)定可逆地阻止細(xì)胞進(jìn)入有絲分裂。超排后分離出受精卵，培養(yǎng)至2-cell期，進(jìn)入第二次有絲分裂約48~54h。不久，裂為四細(xì)胞。為了優(yōu)化條件，用幾組諾考達(dá)唑濃度培養(yǎng)細(xì)胞。阻抑需求量近似或稍高于合子。為確定抑制是否影響胚胎活性，去除抑制，并培養(yǎng)至卵裂期。91%胚胎到達(dá)卵裂期，說(shuō)明諾考達(dá)唑?qū)ζ浒l(fā)育無(wú)顯著性影響，短暫抑制對(duì)胚胎無(wú)毒。

用0.1 mg/ml諾考達(dá)唑處理時(shí)，紡錘體不穩(wěn)定且無(wú)規(guī)則，可能因太紊亂而導(dǎo)致有絲分裂不正常。但Hoffman光學(xué)對(duì)比下，仍清晰可見(jiàn)。CB處理2-cell胚胎，紡錘體與染色體復(fù)合體仍可被鑒別，并可借顯微操作去除。用Hoechst 33342染色，顯示染色體成功去除。只有一個(gè)胞質(zhì)去核，以直接對(duì)比移植及未移植胞質(zhì)的發(fā)育潛能。

為了優(yōu)化核移植測(cè)定，用諾考達(dá)唑處理小鼠ES，并注到去核胞質(zhì)中。為獲得該發(fā)育圖，用表達(dá)櫻紅色熒光組蛋白H2B的細(xì)胞作為供體核，染色體和核均有表達(dá)，便于確認(rèn)。抑制解除后，兩胞質(zhì)完成有絲分裂，并進(jìn)入4-cell期。與期望一樣，有兩個(gè)細(xì)胞表達(dá)櫻紅色H2B，表明攜帶供體核，并且這些4-cell胚胎可以發(fā)育到桑葚胚和囊胚。為了排除未處理胞質(zhì)干擾，胚胎核都源于供體。為此，將兩胞質(zhì)融合，形成一個(gè)四倍體的2-cell期胚胎。有絲分裂期去核，注入二倍體ES。54%分裂為兩個(gè)細(xì)胞，78%發(fā)育到囊胚。滋養(yǎng)層及內(nèi)細(xì)胞團(tuán)均有H2B表達(dá)，表明都源于供體核。囊胚的空腔化是由一系列新基因表達(dá)介導(dǎo)，其中包括編碼Na/K-ATP酶及水通道蛋白基因。因此，供體ES可重編程表達(dá)新基因，并形成一個(gè)有功能的細(xì)胞類型。

若胞質(zhì)能使ES供體核重編程，那么該受體就可能分化出ICM和滋養(yǎng)層。如果在有絲分裂期不能重編程，則說(shuō)明該供體核僅對(duì)ICM有作用。為此，用Hoechst 33342 染色，發(fā)現(xiàn)與ICM特殊蛋白Oct4抗體特異性結(jié)合，可以確定表達(dá)情況。觀察發(fā)現(xiàn)，核移植胞質(zhì)對(duì)內(nèi)細(xì)胞團(tuán)和滋養(yǎng)層均有作用。由此推斷，當(dāng)二細(xì)胞胚胎的重編程能力較低或較弱時(shí)，可能會(huì)優(yōu)先誘發(fā)形成ICM，然而還無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)證據(jù)。50%滋養(yǎng)層及43%ICM由核移植胞質(zhì)分化而來(lái)。總之，陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目與未處理胞質(zhì)的類似或相同。這說(shuō)明核移植對(duì)細(xì)胞數(shù)目的影響很小，重編程相對(duì)完整。

為確定核移植胞質(zhì)能否進(jìn)一步發(fā)育，將移植后的胚胎植入假孕母鼠，對(duì)其后代進(jìn)行評(píng)估。本實(shí)驗(yàn)受體胚胎來(lái)源于黑色小鼠，而供體細(xì)胞核源于棕色小鼠。111例囊胚均有紅色熒光，說(shuō)明移植后的胞質(zhì)重編程顯著。剖腹產(chǎn)出七只幼仔，全部存活至成年，無(wú)呼吸衰竭現(xiàn)象。其中5只為黑色，說(shuō)明主要或完全源于未處理卵裂球。然而，第六只小鼠，30%被毛為棕色，第七只小鼠為棕色。棕色被毛說(shuō)明，它們屬于嵌合體，由重編程及正常細(xì)胞共同組成。

為確定是否含有供體核基因組，進(jìn)行了組織學(xué)分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)源于供體核的陽(yáng)性細(xì)胞在肺、腸及皮膚顯著。說(shuō)明核移植胞質(zhì)重編程的胚胎發(fā)育良好。

體外受精初期，已有40多萬(wàn)胚胎被凍存。如果體細(xì)胞核移植入胞質(zhì)的重編程能進(jìn)一步完善，保守估計(jì)，將有超過(guò)10萬(wàn)的胚胎可被有效用于人類重編程。然而，如果用于生產(chǎn)人類特異性遺傳ES，那么這些ES應(yīng)源于此法獲得的胚胎，且可以重編程終末分化的成人細(xì)胞。

為了確定ES是否源于核移植胚胎，將14個(gè)嵌合體胚與MEF培養(yǎng)以誘導(dǎo)ES產(chǎn)生。每個(gè)胚都附著于飼養(yǎng)層，其中七個(gè)形成ICM，由兩種經(jīng)過(guò)不同處理的細(xì)胞組成。6/7的卵裂球形成了ES，其中3個(gè)源于未處理和核移植卵裂球。挑選陽(yáng)性克隆擴(kuò)增，PCR結(jié)果證明含有供體基因組。另外，核移植ES中表達(dá)Oct4，并且40只小鼠含有正常核型。當(dāng)注入到卵裂球后，可產(chǎn)生嵌合體小鼠。

進(jìn)一步要證明的是，2-cell期胚胎可對(duì)終末分化的細(xì)胞重編程。如T淋巴細(xì)胞，但效率很低。因此為分析T細(xì)胞，以攜帶調(diào)控GFP表達(dá)轉(zhuǎn)基因的Oct4(Oct4::GFP)的細(xì)胞為供體。該基因在體組織不表達(dá)無(wú)熒光。然而，近年來(lái)重編程研究，包括定義轉(zhuǎn)錄因子、細(xì)胞融合及核移植都證明Oct4::GFP報(bào)告基因是重編程完成的一個(gè)標(biāo)志。

CD4+T細(xì)胞源于轉(zhuǎn)基因Oct4::GFP鼠的脾臟及淋巴結(jié)。熒光細(xì)胞分選系統(tǒng)分析結(jié)果表明，大于92%細(xì)胞確實(shí)是CD4+T淋巴細(xì)胞。為了T細(xì)胞核移植，用諾考達(dá)唑處理純化，使其阻滯在含有CD33、CD28抗體的有絲分裂期。同其他體細(xì)胞一樣，T細(xì)胞也不表達(dá)Oct4::GFP。同ES一樣，有絲分裂期的T細(xì)胞核易植入2-cell期胚胎的胞質(zhì)。移植后，胚胎卵裂，并可發(fā)育到囊胚期。20h后，24/67的胚胎發(fā)育到6-8cell期，24/24的胚胎表達(dá)GFP。Oct4::GFP表達(dá)說(shuō)明含有供體T細(xì)胞核，且成功重編程。桑葚胚期和囊胚期相繼高度表達(dá)Oct4::GFP，這說(shuō)明重編程穩(wěn)定。

總體來(lái)說(shuō)，核移植證明胚胎卵裂期的胞質(zhì)有重編程能力，且足以建立ES系、嵌合體的生殖和對(duì)終末分化細(xì)胞的重編程。有趣的是，當(dāng)分裂為4-cell前，蛋白質(zhì)和轉(zhuǎn)錄物與受精卵及卵母細(xì)胞顯著不同。我們發(fā)現(xiàn)淋巴染色體核轉(zhuǎn)移后約20h，Oct4::GFP再活化，與正常受精卵大致相同。結(jié)果說(shuō)明二細(xì)胞胚胎卵裂球可對(duì)外來(lái)供體染色體重編程，使之達(dá)到受體卵裂球類似的狀態(tài)。重編程后的細(xì)胞會(huì)進(jìn)一步發(fā)育，而不是復(fù)原為原始卵母細(xì)胞或受精卵轉(zhuǎn)錄前。

卵母細(xì)胞、受精卵、胚胎胞質(zhì)及ES可對(duì)分化的細(xì)胞重編程，說(shuō)明植入前發(fā)育過(guò)程存在重編程活性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞類特異性轉(zhuǎn)錄因子能調(diào)節(jié)重編程，說(shuō)明如果核移植或染色體移植方法能被完善，那么任何細(xì)胞都可以被重編程。事實(shí)上，特殊細(xì)胞類型的重編程能力與特異性轉(zhuǎn)錄因子等同。

通過(guò)核移植使人類ES傳代仍占主導(dǎo)地位。只有用不同重編程方法生產(chǎn)的同一細(xì)胞系才能精確比較。本試驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明，對(duì)于核移植研究，卵裂期的人類胚胎是一類尚未發(fā)掘的重要資源。人類胚胎通常在4-8cell期凍存。尤其，人類4-cell期時(shí)的單一胞質(zhì)與小鼠受精卵的大小相同，而人類8-cell期的單一胞質(zhì)的直徑與小鼠2-cell期的類似。因此操作方法類似，具有可行性。核移植的材料來(lái)源較新鮮人類卵母細(xì)胞或冷凍受精卵更普遍。

實(shí)驗(yàn)程序

方法是按小鼠受精卵有絲分裂期的核移植程序進(jìn)行。即BD1F 2-cell胚置于0.2mg/ml的諾考達(dá)唑中，抑制有絲分裂。去核：諾考達(dá)唑(0.02–0.04 mg/ml)及高濃度CB(10 mg/ml)的胞質(zhì)流動(dòng)量最大，易去核。HCG處理后50~57h，去核并移植。取pCAGGS:H2B顯陽(yáng)性的雄性ES作為供體核。

收集6~10周齡的B6jcBA-Tg(Pou5fI-EGFP)2Mnn/J 或 H2B-GFP轉(zhuǎn)基因小鼠的脾細(xì)胞和淋巴細(xì)胞，用抗體（CD8， CD11b， CD45R/B220， CD49b， and TER-119）標(biāo)記。純化CD4+T細(xì)胞，流體細(xì)胞計(jì)數(shù)法測(cè)定純化質(zhì)量。在六孔板培養(yǎng)，1*107個(gè)/孔，5ml RPMI完全培養(yǎng)基。培養(yǎng)皿預(yù)先用1mg/ml的抗CD33及抗CD28抗體處理，使細(xì)胞擴(kuò)散，培養(yǎng)1~3天，達(dá)到最大增殖比率，于0.1mg/ml的諾考達(dá)唑中8h，抑制有絲分裂，（1%–10%）的細(xì)胞用于核移植。