壁虎提取物誘導HepG2肝癌細胞凋亡的研究

摘要：目的：探討壁虎提取物（GEE）對體外培育人肝癌HepG2肝癌細胞凋亡的影響。

方法：采用MTT法考查GEE對HepG2增殖的抑制作用，普通光鏡觀察、熒光染色法觀察細胞形態的改變及細胞凋亡，流式細胞儀（FMC）觀察細胞周期變化和凋亡峰的出現。

結果：0.4～1.6mg/ml壁虎提取物對HepG2增殖產生抑制作用，且呈明顯的時-效、量-效關系（P<0.05）。光鏡觀察可見貼壁細胞數量明顯減少，細胞碎片和懸浮細胞數目明顯增加，熒光染色顯示細胞核顯著收縮，呈致密濃染。FCM結果表明1.6mg/ml壁虎提取物處理細胞24h后使HepG2出現明顯的凋亡峰，并將細胞周期阻滯于S期和G2/M期。

結論：壁虎提取物能誘導HepG2細胞凋亡。

關鍵詞：壁虎細胞凋亡HepG2

【中圖分類號】R4【文獻標識碼】A【文章編號】1008-1879（2012）11-0009-02

壁虎又稱守宮、天龍、蝎虎等，古代“五毒”之一，具有補肺腎、易精血、通絡起廢、鎮痙祛風等功效。壁虎在臨床廣泛地用于治療多種疑難雜癥，對多種惡性腫瘤，尤其是肝癌、肺癌、食管癌、胃癌、乳腺癌、宮頸癌等常見多發惡性腫瘤有獨特的療效。近年來對該藥的研究有不少進展，但目前對壁虎抗腫瘤機制不明了。壁虎作為中藥還未載入國家藥典，還未得到應有重視，國內外同仁對其有效成分、作用機制研究不多。因此研究壁虎對體外腫瘤細胞增殖的抑制作用有可能發現壁虎的抗癌機制。本文擬對壁虎提取物為研究對象，研究其體外作用人肝癌HepG2細胞后的增殖抑制情況，能否誘導凋亡及相關分子機制，為壁虎的藥用開發提供科學理論和臨床應用依據。

1實驗材料

1.1細胞株。人肝癌細胞株HepG2（ATCC，美國）。

1.2藥物。壁虎或為壁虎科動物無蹼壁虎或其他幾種壁虎的全體。處理方法：高速組織搗碎機使細胞裂解，離心，抽提，旋轉蒸發冷凍干燥，濃縮成干粉。

1.3主要試劑及試劑盒。MTT（Genview），細胞凋亡-Hoechest染色試劑盒（南京凱基生物發展有限公司），RPIM1640（GIBCO），胎牛血清（杭州四季青），碘化丙啶（Sigma），青霉素/鏈霉素（HyClone公司），其余藥品均為國產分析純。

1.4主要儀器。熒光倒置顯微鏡（OLYMPUS公司），倒置顯微鏡XSZ-D2型（重慶光學儀器廠），冷凍干燥儀（MARTIN CHRIST公司），酶標儀（中科院生物物理所），BI-2000生物醫學圖像分析系統（成都泰盟公司），流式細胞儀（Beckman公司）。

2實驗方法

2.1HepG2細胞的培養和處理。HepG2進入對數生長期時可進行以下操作。

2.2細胞毒性試驗。采用MTT法：實驗設調零組（空白組）、陰性對照組、藥物處理組。藥物處理組設定7個不同濃度（0.125、0.25、0.5、1、2、4、8mg/ml），計算增殖抑制率。

2.3普通光鏡細胞形態觀察。細胞接種方法同細胞增殖抑制實驗，經一定量梯度濃度的藥液處理48h后，和陽性對照組（阿霉素處理）、陰性對照組的HepG2細胞置于倒置光學顯微鏡下觀察細胞形態。

2.4熒光染色觀察細胞凋亡。將無菌蓋玻片置于六孔板內，于蓋玻片上種入細胞培養過夜，待蓋玻片上細胞匯合度約為50%-80%時加入一定量的藥液，繼續培養24h。設對照組。后按照細胞凋亡-Hoechest染色試劑盒的說明操作，用熒光倒置顯微鏡（激發波長340nm，吸收波長450nm）觀察拍照。

2.5FCM檢測。收集經一定濃度藥物作用24h后1×107個細胞，冷PBS（PH7.2，0.1M）清洗2遍，70%的冷乙醇于4℃固定后送檢，每個樣品測試約1.2×104個細胞。

3實驗結果

3.1壁虎對HepG2增殖的抑制作用。壁虎提取物各劑量組均有一定程度的抑制HepG2細胞增殖，并且隨著劑量和時間推移，抑制率增強，具有明顯時間依賴性和劑量依賴性。

3.2普通光鏡觀察結果。陰性對照組HepG2細胞生長密集，細胞呈梭形或多角形，細胞彼此之間緊密接觸。壁虎提取物處理后的貼壁細胞面積變小出現圓形或橢圓，間有細胞碎片，細胞數量明顯減少，同時細胞形態發生變化，細胞從多邊形變成圓形，呈凋亡細胞改變，胞漿出現空泡，體積縮小，細胞間隙增大，隨時間推移，細胞數目進一步減少，見較多的凋亡和壞死細胞；陽性對照細胞小而圓，細胞數量劇減，呈凋亡細胞改變，可見凋亡和壞死并存現象。

3.3熒光染色結果。正常HepG2細胞核較大，呈彌散均勻藍色熒光，但藍色熒光較淺；實驗組的細胞形態不規則，細胞核或細胞質內可見致密濃染的熒光顆粒，新月樣熒光，藍色熒光的強度較大。壞死對照組也可見顆粒狀熒光，但呈松散和淡染狀。

3.4FCM檢測結果。陰性對照組表明HepG2細胞中DNA含量分布較集中；由流式細胞分析結果，表明用藥后G0/G1期細胞比例顯著減小，且在G0/G1期前出現一個顯著的凋亡峰（AP峰）。用藥組與陰性對照組相比，細胞周期被阻滯于S期和G2/M期，而G0/G1期的比例顯著下降。

4討論

在我國傳統中醫藥學中，壁虎常被組成方劑用于燥濕健脾、祛風散寒，也可活血消腫、治療炎癥、抗癌，但是壁虎的抗癌作用機制還未見報道。本實驗的結果表明，0.125～8mg/mL壁虎提取物對HepG2有明顯增殖抑制作用，且有較明顯的量-效、時-效關系；而2mg/mL壁虎提取物對HepG2發生凋亡產生較典型的凋亡性狀，細胞可能處于凋亡初期或中期。流式細胞儀檢測結果表明，用藥后HepG2出現明顯阻滯于S期和G2/M期，減少細胞向G2期和M期轉化。以上結果表明，壁虎提取物具有顯著誘導HepG2產生凋亡的作用。具有極大臨床應用研究潛力。

參考文獻

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