基于SRAP—PCR分析的百合鱗片DNA提取

摘要：采用改良的CTAB法從百合（Liliwn lancifolium Thunb.）鱗片中提取DNA，采用紫外分光光度法和瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)所提取的DNA質(zhì)量，并進(jìn)行SRAP-PCR分析。結(jié)果表明，改良的CTAB法提取的百合DNA A260 nm/A280 nm為1.69，濃度為0.30 μg/μL。瓊脂糖膠電泳檢測(cè)結(jié)果顯示提取的DNA為清晰的條帶，RNA去除干凈，無(wú)降解現(xiàn)象。SRAP-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物多態(tài)性好，穩(wěn)定性高，可用于遺傳多樣性分析。

關(guān)鍵詞：百合（Liliwn）；鱗片；SRAP；DNA提取

中圖分類(lèi)號(hào)：Q523 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2012）21-4896-03

DNA Extraction from Squama Leaves of Liliwn lancifolium for SRAP-PCR Analysis

LI Jia-min，ZHOU Xiu-ling

（College of Chemical and Biological Engineering，Yichun University，Yichun 336000，Jiangxi，China）

Abstract： Modified CTAB method was applied to extract DNA from squama leaves of Liliwn lancifolium Thunb.. Ultraviolet spectrophotometry and agarose gel electrophoresis as well as SRAP-PCR were adopted to test the quality of extracted DNA. The results showed that A260 nm/A280 nm of DNA was 1.69， and concentration was 0.30 μg/μL. The agarose gel electrophoresis showed that the DNA had clear band without degradation or RNA. The SRAP-PCR product was with good polymorphism and stability， which could be used for genetic polymorphism analysis of Liliwn.

Key words： Liliwn； squama leaves； SRAP； DNA extraction

相關(guān)序列擴(kuò)增多態(tài)性（Sequence-related amplified polymorphism，SRAP）標(biāo)記因具有簡(jiǎn)便高效、快速穩(wěn)定、共顯性和重復(fù)性好、便于克隆目標(biāo)片段等優(yōu)點(diǎn)而備受青睞，目前已成功地應(yīng)用于作物遺傳多樣性分析、遺傳圖譜的構(gòu)建、重要性狀的標(biāo)記以及相關(guān)基因的克隆等。中藥百合來(lái)源于百合科植物卷丹（Lilium tigrinum）、百合（L. brownii var. viridulum）、細(xì)葉百合（L. pumilum）的干燥肉質(zhì)鱗葉[1]，具有養(yǎng)陰潤(rùn)肺、清心安神的功效，臨床可用于陰虛久咳、痰中帶血、虛煩驚悸、失眠多夢(mèng)、精神恍惚等癥的治療。中國(guó)是百合的故鄉(xiāng)，全世界百合屬植物約有94個(gè)種，起源于中國(guó)的有47個(gè)種、18個(gè)變種[2]，其中36個(gè)種、15個(gè)變種為中國(guó)特有。但目前中國(guó)種植的百合多數(shù)是從國(guó)外引進(jìn)的，而國(guó)內(nèi)現(xiàn)有的百合資源尚未得到充分的利用，且破壞和流失現(xiàn)象十分嚴(yán)重。對(duì)百合的研究也主要集中于中藥材品種基源的整理以及化學(xué)成分的分析。為了充分發(fā)揮中國(guó)豐富的百合資源優(yōu)勢(shì)，進(jìn)行中藥百合的遺傳育種，利用RAPD、SSR、AFLP等分子標(biāo)記研究百合遺傳多樣性已有報(bào)道[3，4]。這些研究中所用百合基因組DNA主要提取自百合幼嫩鱗葉，采樣受到季節(jié)限制。百合鱗片的采樣不受時(shí)間限制，但含有較多的次生代謝產(chǎn)物，提取高質(zhì)量的DNA有一定難度。本研究采用CTAB法從百合鱗片中提取總DNA，檢測(cè)所提取DNA的濃度和純度，為SRAP分析以及百合品種親緣關(guān)系的研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

卷丹百合（Liliwn lancifolium Thunb.）鱗片采集于江西萬(wàn)載縣白水鄉(xiāng)。新鮮百合鱗片清水沖洗后用70%（體積分?jǐn)?shù)，下同）的乙醇消毒，無(wú)菌水沖洗3次，于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

主要儀器包括超低溫冰箱（MDF-382E（N））、水浴鍋（HH-4）、離心機(jī)（TGL-16B）、基因擴(kuò)增儀（XP-G）、雙穩(wěn)定時(shí)電泳儀（DYY-6C）、紫外分光光度計(jì)（UV-2000）、凝膠成像系統(tǒng)；主要試劑NaCl、CTAB、EDTA、Tris、β-巰基乙醇、氯仿、異戊醇、異丙醇等均為分析純，引物由賽百盛基因技術(shù)有限公司合成，PCR反應(yīng)體系試劑購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司。

1.2 方法

1.2.1 CTAB法提取百合鱗片中總DNA[5] 取2 g百合鱗片用液氮研磨成粉末放入1.5 mL離心管中，加入700 μL 65 ℃預(yù)熱的CTAB提取緩沖液（2.5 mol/L NaCl、2% CTAB、0.05 mol/L EDTA、0.1 mol/L Tris、0.01 mol/L β-巰基乙醇），輕輕搖勻，65 ℃水浴60 min，期間輕晃3次；再加700 μL氯仿—異戊醇（體積比24∶1），輕輕顛倒混勻10 min，10 000 r/min離心10 min，轉(zhuǎn)移上清液至一新管中；加入等體積

-20 ℃預(yù)冷的異丙醇混勻，-20 ℃放置30 min，10 000 r/min離心15 min；棄上清液，70%的乙醇沉淀，無(wú)水乙醇洗滌，室溫?fù)]干乙醇；無(wú)菌超純水在4 ℃下溶解DNA，-20 ℃保存。

1.2.2 DNA質(zhì)量的檢驗(yàn) ①紫外分光光度法。將所得DNA提取液稀釋200倍，于紫外分光光度計(jì)上測(cè)定260、280 nm處的吸光度，計(jì)算A260 nm/A280 nm及DNA濃度。②瓊脂糖凝膠電泳。取5 μL提取的DNA溶液進(jìn)行0.8%的瓊脂糖凝膠電泳（70 V、30 min），TE染料染色后，UVP紫外凝膠成像系統(tǒng)上觀察并照相。

1.2.3 SRAP-PCR擴(kuò)增 以提取的百合鱗片DNA為模板進(jìn)行SRAP-PCR擴(kuò)增，引物序列為EM1：TGAGTCCAAACCGGATA，ME1：GACTGCGTACGAA

TTAAT，EM2：TGAGTCCAAACCGGAGC，ME2：GAC

TGCGTACGAATTTGC。反應(yīng)體系為20 μL，其中包括2 mmol/L dNTPs、50 ng引物（each）、50 ng模板DNA、1 U Taq DNA聚合酶、2.5 mmol/L MgCl2、2 μL 10×Buffer和ddH2O。在基因擴(kuò)增儀XP-G上進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)程序?yàn)?4 ℃預(yù)變性4 min；94 ℃變性1 min，35 ℃復(fù)性1 min，72 ℃延伸1 min，5個(gè)循環(huán)；94 ℃變性1 min，50 ℃復(fù)性1 min，72 ℃延伸1 min，35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。2.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)并拍照。

2 結(jié)果與分析

2.1 DNA質(zhì)量檢測(cè)結(jié)果

2.1.1 紫外分光光度法檢測(cè)結(jié)果 用紫外分光光度法對(duì)CTAB法提取的百合鱗片DNA純度和濃度進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果見(jiàn)表1。從表1中可見(jiàn)，百合DNA樣本的A260 nm/A280 nm為1.63～1.75，平均為1.69；DNA濃度為0.24～0.34 μg/μL，平均為0.30 μg/μL。

2.1.2 瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果 采用0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)提取的百合鱗片總DNA，結(jié)果如圖1所示。從圖1可以看出，DNA條帶單一，清晰明亮，RNA去除干凈，無(wú)降解現(xiàn)象。

2.2 SRAP-PCR擴(kuò)增結(jié)果

以提取的百合鱗片總DNA為模板進(jìn)行SRAP-PCR擴(kuò)增，每對(duì)引物組合（EM1+ME1、EM1+ME2、EM2+ME1、EM2+ME1）分別擴(kuò)增3個(gè)DNA樣本，做2次重復(fù)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖2所示。由圖2可以看出，擴(kuò)增產(chǎn)物條帶清晰、多態(tài)性好，且兩兩重復(fù)性好、穩(wěn)定性高。可見(jiàn)采用改良的CTAB法提取百合鱗片總DNA所得DNA純度高、質(zhì)量好，適于進(jìn)行SRAP-PCR等分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)。

3 小結(jié)與討論

植物總DNA的提取是一項(xiàng)常規(guī)的分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)。植物材料中的多糖在DNA提取過(guò)程中會(huì)形成難溶的膠狀物與DNA共沉淀。從多糖、多酚含量較高的植物中提取高質(zhì)量的DNA仍具有一定難度。目前已有多種方法去除DNA提取過(guò)程中的多糖[5]，多數(shù)方法針對(duì)的是糖類(lèi)含量少的新鮮材料，需經(jīng)過(guò)繁瑣的純化步驟。百合鱗片中含有較多的糖類(lèi)、酚類(lèi)等次生代謝產(chǎn)物，嚴(yán)重影響了DNA的提取質(zhì)量。采用常規(guī)的CTAB法提取百合總DNA，65 ℃水浴時(shí)會(huì)氧化變褐，在加入乙醇沉淀DNA時(shí)多糖也被沉淀，在SRAP-PCR擴(kuò)增中譜帶極弱或無(wú)譜帶出現(xiàn)，不能滿足SRAP-PCR實(shí)驗(yàn)要求。本研究將CTAB提取緩沖液中NaCl濃度提高到2.5 mol/L、加入0.01 mol/L β-巰基乙醇，水浴過(guò)程中管內(nèi)材料無(wú)褐色出現(xiàn)，說(shuō)明組織的氧化程度降低；用75%的乙醇沉淀DNA時(shí)多糖含量也降低，DNA的質(zhì)量明顯提高。將提取的百合鱗片DNA用于SRAP-PCR擴(kuò)增，出現(xiàn)明顯的譜帶，重復(fù)性和穩(wěn)定性較好，完全滿足擴(kuò)增的需要，可用于基于SRAP分子標(biāo)記的百合遺傳多樣性研究。

參考文獻(xiàn)：

[1] 國(guó)家藥典委員會(huì). 中華人民共和國(guó)藥典（一部）[S].北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2005.80.

[2] 王連英.花卉學(xué)[M].北京：中國(guó)林業(yè)出版社，1988.362-364.

[3] 張克中，賈月慧，張啟翔，等.部分中國(guó)野生百合親緣關(guān)系的AFLP技術(shù)分析[J]. 東北林業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2008，36（2）：19-22.

[4] 左志銳，穆 鼎，高俊平，等.百合遺傳多樣性及親緣關(guān)系的RAPD分析[J].園藝學(xué)報(bào)，2005，32（3）：468-472.

[5] 崔光紅，唐曉晶，黃璐琦.含淀粉及多糖類(lèi)中藥材DNA的提取方法研究[J].中國(guó)中藥雜志，2006，31（16）：1365-1367.

收稿日期：2012-03-13

基金項(xiàng)目：江西省宜春市科技計(jì)劃項(xiàng)目（JXYC2009KNA007）

作者簡(jiǎn)介：李家敏（1979-），女，貴州福泉人，講師，碩士，主要從事藥用植物生物技術(shù)研究，（電話）15180563015（電子信箱）jiaminligz@163.com。