高產釀酒酵母SCY6生長與發酵條件的優化

摘要：采用高產釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）SCY6發酵葡萄糖產乙醇，設計單因素試驗考察該酵母菌株適宜的生長條件，采用正交試驗優化酵母發酵產乙醇的條件。結果表明，該酵母菌株的最適生長溫度和pH分別為28 ℃、5.0，培養基中葡萄糖質量分數為15%時其生長狀態較好。正交試驗結果表明，最適合該釀酒酵母發酵產乙醇的條件為玉米漿和（NH4）2SO4作為氮源，用量分別為20 g/L和2 g/L，接種量為4%，pH 5.0。在此條件下進行發酵，發酵液中乙醇體積分數可達7.77%，葡萄糖轉化率達83.82%。

關鍵詞：釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）；生長；發酵；乙醇

中圖分類號：TS261.1 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2012）21-4856-04

Optimization of Growth and Fermentation Conditions for High Ethanol-Producing Saccharomyces cerevisiae Strain SCY6

GU Hua-xiang，SONG Chen，LI Xun

（College of Chemical Engineering， Nanjing Forestry University/Jiangsu Key Lab of Biomass-Based Green Fuels and Chemicals，

Nanjing 210037， China）

Abstract： The high ethanol-producing Saccharomyces cerevisiae strain SCY6 was used to ferment glucose to ethanol. Single factor tests were conducted to optimize the cultivation conditions； while orthogonal design was adopted to optimize ethanol fermentation conditions. The results showed that the optimum temperature and pH for yeast growth was 28 ℃ and 5.0， respectively. The yeast grew well when mass ratio of glucose in YPD medium was 15%. The result of orthogonal test showed that the optimal ethanol fermentation conditions were， 2 g/L（NH4）2SO4 and 20 g/L corn syrup as N source； inoculation dose， 4% volume fraction； and pH 5.0. The yield of ethanol reached 7.77%； and the conversion rate of glucose was 83.82% under these conditions.

Key words： Saccharomyces cerevisiae； growth； fermentation； alcohol

隨著科技的不斷發展，人們對燃料型能源的需求日益加大。石油煤炭資源不僅污染環境，而且是不可再生資源。乙醇作為石油的替代能源，具有污染小、可再生、易運輸和易儲藏的特點，將農林廢棄物轉化為燃料乙醇是解決能源危機的一條理想途徑[1，2]。燃料乙醇的生產分為化學合成和生物轉化兩種方式，其中生物轉化法以其低污染和高效率的特點更具競爭力。釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）是生物轉化法發酵產乙醇最常用的菌種之一，目前對釀酒酵母發酵工藝的改進已成為研究的熱點[2-4]。本研究對一株高產釀酒酵母的生長與發酵條件進行優化，以期為實現乙醇的低成本、高效率生產，促進酵母在乙醇發酵工業中的應用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

試驗用菌種為江蘇省生物質綠色燃料與化學品重點實驗室篩選的一株高產釀酒酵母SCY6。

主要儀器包括超凈工作臺（AIRTECH）、生物分光光度計（Eppendorf）、ZHWY-2102C系列振蕩培養箱（上海智城分析儀器制造有限公司）、WFZ UV-200型紫外分光光度計（尤尼柯（上海）儀器有限公司）、SBA-40E生物傳感分析儀（山東省生物傳感器重點實驗室）等。

1.2 方法

1.2.1 釀酒酵母生長條件的優化 ①釀酒酵母生長曲線的繪制。以5%的接種量（體積分數，下同）將釀酒酵母菌株接入50 mL YPD液體培養基中（pH 5.0），在28 ℃培養，每隔5 h取樣測OD600 nm，至OD600 nm變化趨緩為止，根據酵母濃度（血球計數法）和OD600 nm繪制酵母的生長曲線[5，6]。②培養溫度。以5%的接種量接入對數生長期的酵母種子液至50 mL YPD液體培養基中（pH 5.0），分別在24、26、28、30 ℃振蕩培養20 h后測定菌液OD600 nm，確定酵母生長的最適溫度。③pH。以5%的接種量接入對數生長期的酵母種子液于50 mL YPD液體培養基中，調菌液pH分別為4.0、4.5、5.0、5.5、6.0，在28 ℃下振蕩培養20 h后測定菌液OD600 nm，確定酵母生長的最適pH。④葡萄糖質量分數[7]。分別在50 mL YPD液體培養基（pH 5.0）中添加質量分數10%、15%、20%、25%、30%、35%的葡萄糖，在28 ℃振蕩培養20 h后測定菌液的OD600 nm。

1.2.2 單因素試驗優化釀酒酵母的發酵條件 ①接種量。分別按4%、6%、8%的接種量將釀酒酵母種子液接入含葡萄糖質量分數為15%的50 mL YPD培養基中，在28 ℃、150 r/min的培養箱中發酵培養，24 h后取樣測定發酵液中的乙醇含量。②pH。YPD培養基中添加葡萄糖的質量分數為15%，調節培養基pH分別為4.0、4.5、5.0、5.5、6.0，以5%的接種量接入釀酒酵母種子液，在28 ℃、150 r/min的培養箱中發酵培養，24 h后取樣測定其乙醇含量。③氮源。根據表1配制含氮源的培養基，其中氮源1的添加量為20 g/L，氮源2的添加量為2 g/L，并加入一定量的無機鹽，以YPK培養基為空白對照。采用①～③優化后的條件進行發酵培養，24 h后取樣測定其乙醇含量。

1.2.3 正交試驗優化釀酒酵母發酵條件 根據單因素試驗結果，設計正交試驗考察玉米漿添加量、（NH4）2SO4添加量、pH和接種量對發酵液中乙醇體積分數的影響[8，9]，因素與水平見表2。

1.2.4 指標測定 ①葡萄糖殘余量：采用生物傳感分析儀測定[10]；②乙醇含量：采用比色法測定發酵液中乙醇的體積分數[11]；③酵母菌濃度：采用生物分光光度計測定菌液的OD600 nm。

2 結果與分析

2.1 高產釀酒酵母生長條件的優化結果

2.1.1 釀酒酵母的生長曲線 釀酒酵母生長曲線見圖1，可以看出，釀酒酵母SCY6菌株在培養18 h后達到穩定生長期，且OD600 nm和菌液濃度反映的生長情況基本一致，因此可選擇培養14 h的酵母作為接種出發菌種，并以OD600 nm作為后期反映釀酒酵母生長情況的指標。

2.1.2 釀酒酵母生長的最適溫度 釀酒酵母SCY6菌株在不同溫度下的生長情況見圖2?？梢钥闯霎敎囟扔?4 ℃上升到28 ℃時菌液的OD600 nm逐漸升高，而溫度高于28 ℃時OD600 nm急劇下降，可能是由于高溫影響了該菌的代謝酶活性，從而抑制其生長?？梢奡CY6的最適生長溫度為28 ℃。

2.1.3 釀酒酵母生長的最適pH 從圖3可知，pH由4.0升高到5.0，菌液的OD600 nm增大，在pH 5.0時達到最大，之后隨pH的增大菌液的OD600 nm逐漸下降，可見釀酒酵母生長的最適pH為5.0。

2.1.4 葡萄糖添加量對酵母生長的影響 培養基中添加不同質量分數的葡萄糖，釀酒酵母的生長情況如圖4所示?？梢钥闯?，葡萄糖質量分數為15%時菌株長勢最好，其OD600 nm最高。葡萄糖質量分數低于15%時，菌株生長所需糖量不足，生長速度減慢；葡萄糖濃度過高，會造成酵母細胞的失水，菌株生長受到抑制。

2.2 釀酒酵母發酵條件的單因素試驗結果

2.2.1 接種量對釀酒酵母發酵的影響結果 按不同的接種量接入活化的酵母種子液，發酵產乙醇的結果見圖5?？梢钥闯?，接種量為6%時發酵液中乙醇體積分數明顯高于接種量為4%和8%時。分析原因，可能是接種量為4%時酵母的生長量和酶的分泌量不夠，導致發酵所產乙醇量少；而接種量大于6%時酵母的生長量過大，代謝消耗的葡萄糖多，且老化的菌體量偏大，代謝副產物增多，從而導致發酵液中的乙醇含量偏低。

2.2.2 pH對釀酒酵母發酵的影響結果 由圖6可知，pH為5.0時發酵液中乙醇體積分數最高，發酵效果最好，釀酒酵母的最適發酵pH與最適生長pH一致。說明過酸或過堿環境不僅會對菌種的生長不利，同時也會抑制發酵途徑中的酶促反應，使催化效率降低。

2.2.3 氮源對釀酒酵母發酵的影響結果 不同氮源組合對SCY6的發酵效果有顯著影響，由圖7可知，以牛蛋白胨和（NH4）2SO4作為混合氮源的培養基（6）中乙醇含量最高，發酵液中乙醇體積分數可達到7.50%，其次是玉米漿和（NH4）2SO4作為混合氮源的培養基（2），乙醇體積分數為7.04%?？紤]到牛蛋白胨的價格比較貴，因此選擇價格比較低廉的玉米漿和（NH4）2SO4混合氮源培養基進行乙醇發酵。

2.3 釀酒酵母發酵正交試驗結果

采用正交試驗對該高產釀酒酵母的發酵條件進行優化，結果見表3?？梢钥闯?個因素中對發酵后菌液中乙醇體積分數影響最大的是玉米漿含量，其次是接種量，pH和（NH4）2SO4含量的影響較小。最適的發酵條件為A2B2C2D1，即玉米漿含量20 g/L、（NH4）2SO4含量2 g/L、接種量4%、pH 5.0。在該條件下進行驗證試驗，發酵液中乙醇體積分數為7.77%，優于正交試驗組合，殘糖量為4.6 g/L，此時葡萄糖轉化率為83.82%，發酵效果良好。

3 結論

影響釀酒酵母生長和乙醇發酵的因素有很多，對實驗室篩選的一株高產釀酒酵母SCY6的生長條件進行初步研究，發現該酵母菌株的最適生長溫度和pH分別為28 ℃、5.0，培養基中葡萄糖質量分數為15%時其生長狀態較好。正交試驗結果表明最適合該釀酒酵母發酵產乙醇的條件為玉米漿和（NH4）2SO4作為氮源，用量分別為20 g/L和2 g/L，接種量為4%，pH 5.0。在此條件下進行發酵，發酵液中乙醇體積分數可達7.77%，葡萄糖轉化率達83.82%。

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收稿日期：2012-02-07

基金項目：國家林業局引進國際先進林業科學技術項目（2009-4-63）；江蘇高校優勢學科建設工程資助項目（PAPD）

作者簡介：顧華祥（1990-），男，江蘇鹽城人，在讀本科生，（電話）13701585718（電子信箱）guhuaxiang2008@163.com；

通訊作者，李 迅（1975-），女，副教授，碩士生導師，（電子信箱）xunlee@163.com。