CsM與PMCA可能參與眼柄切除誘導(dǎo)克氏原螯蝦卵巢成熟的早期分子過(guò)程

摘要：目前對(duì)克氏原螯蝦（Procambarus clarkii）眼柄切除誘導(dǎo)卵巢成熟的分子機(jī)制還很不清楚。借鑒國(guó)外最新研究結(jié)果，探討了克氏原螯蝦單側(cè)眼柄切除后第1、7、15天體長(zhǎng)、體重及卵巢的一系列變化情況，利用實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)比較分析了眼柄切除前、后卵巢組織中鈣調(diào)蛋白基因（CaM）與質(zhì)膜Ca2+-ATPase基因（PMCA）的表達(dá)情況。結(jié)果表明，在克氏原螯蝦眼柄切除誘導(dǎo)卵巢成熟的早期分子過(guò)程中，鈣信號(hào)通路可能發(fā)揮了重要作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果為進(jìn)一步深入研究克氏原螯蝦眼柄切除促進(jìn)卵巢成熟的分子機(jī)制積累了研究資料。

關(guān)鍵詞：克氏原螯蝦（Procambarus clarkii）；眼柄切除；卵巢成熟；實(shí)時(shí)定量PCR；鈣信號(hào)通路

中圖分類(lèi)號(hào)：S917.4 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2012）21-4846-04

CaM and PMCA might Be Involved in Induction of Procambarus clarkii Ovarian Maturation by Eyestalk Ablation in the Early Molecular Processes

GUAN Zheng-bing1，SHUI Yan2，ZHOU Xin2，3，XU Zeng-hong2，ZHAO Chao-yang2，LIAO Xiang-ru1

（1. School of Biotechnology， Jiangnan University， Wuxi 214122， Jiangsu， China； 2. Freshwater Fisheries Research Center， Chinese Academy of Fishery Sciences / Key Laboratory of Freshwater Fisheries and Germplasm Resources Utilization， Ministry of Agriculture， Wuxi 214081， Jiangsu， China； 3. Wuxi Fishery College， Nanjing Agricultural University， Wuxi 214081， Jiangsu， China）

Abstract：The molecular mechanism of induction to Procambarus clarkii ovarian maturation by eyestalk ablation is still unclear. Based on the recent studies， the 1， 7 and 15 days body length， weight and ovarian changes in P. clarkii after unilateral eyestalk ablation were explored， and the expression level of calmodulin（CaM） and plasma membrane Ca2+-ATPase genes（PMCA） in ovarian tissues before and after eyestalk ablation were analyzed by using real-time quantitative PCR. The results suggested that the calcium signaling pathway might play an important role in induction of P. clarkii ovarian maturation by eyestalk ablation in the early molecular processes. These data will be helpful for further in-depth studies of eyestalk ablation mechanism to induce ovarian maturation in P. clarkii.

Key words： Procambarus clarkii； eyestalk ablation； ovarian maturation； real-time quantitative PCR； calcium signaling pathway

甲殼動(dòng)物的眼柄中存在著X器官-竇腺（X-organ sinus gland，XO-SG）復(fù)合體，該復(fù)合體是甲殼動(dòng)物的神經(jīng)內(nèi)分泌調(diào)控中心，能分泌與生長(zhǎng)、蛻皮及性腺發(fā)育相關(guān)的多種激素[1]。其中，性腺抑制激素（Gonad-inhibiting hormone，GIH）對(duì)甲殼動(dòng)物的性腺發(fā)育起主要調(diào)節(jié)作用，能夠抑制雌性動(dòng)物卵巢卵黃原的合成及促性腺激素（Gonadotropins）的表達(dá)[2]。大量研究表明，通過(guò)切除甲殼動(dòng)物眼柄進(jìn)而破壞眼柄中X器官-竇腺?gòu)?fù)合體的功能，可以起到加速卵巢內(nèi)卵黃積累、促進(jìn)卵巢成熟的作用[3-6]。

但截至目前，國(guó)際上對(duì)甲殼動(dòng)物切除眼柄后體內(nèi)誘導(dǎo)性腺發(fā)育成熟的分子機(jī)制還知之甚少。2011年，Uawisetwathana等[7]基于cDNA芯片的轉(zhuǎn)錄組學(xué)方法研究了斑節(jié)對(duì)蝦（Penaeus monodon）單側(cè)眼柄切除前、后的基因組表達(dá)差異，發(fā)現(xiàn)在眼柄切除早期（1 d左右）參與鈣信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)基因（如CaM）、促激素分泌相關(guān)基因（如Thrombospondin）及發(fā)育過(guò)程相關(guān)基因（如Innexin2）的表達(dá)水平都大幅上調(diào)；隨后研究人員通過(guò)KEGG pathway分析，預(yù)測(cè)出與這些基因相關(guān)的促性腺激素釋放激素信號(hào)通路（Gonadotropin releasing hormone signaling pathway）、鈣信號(hào)通路（Calcium signaling pathway）及孕酮介導(dǎo)的卵母細(xì)胞成熟途徑（Progesterone-mediated oocyte maturation pathway）可能參與了眼柄切除后誘導(dǎo)斑節(jié)對(duì)蝦卵巢成熟的早期分子過(guò)程。

本研究借鑒上述國(guó)外最新研究結(jié)果，探討了克氏原螯蝦（Procambarus clarkii）單側(cè)眼柄切除后卵巢的一系列變化情況，利用實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)比較分析了眼柄切除前、后卵巢組織中鈣調(diào)蛋白基因（CaM）與質(zhì)膜Ca2+-ATPase基因（PMCA）的表達(dá)情況，初步明確在克氏原螯蝦中鈣信號(hào)通路是否參與了眼柄切除早期誘導(dǎo)卵巢成熟的分子過(guò)程，為進(jìn)一步深入研究克氏原螯蝦眼柄切除促進(jìn)卵巢成熟的分子機(jī)制積累了一定的研究資料。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)用克氏原螯蝦雌蝦于2012年1月取自江蘇寶龍集團(tuán)有限公司大豐養(yǎng)殖基地。選取體質(zhì)健壯、活動(dòng)力強(qiáng)、附肢完整的克氏原螯蝦雌蝦共40尾，體長(zhǎng)為12.8～13.9 cm，體重為31.2～39.1 g。

1.2 方法

1.2.1 單側(cè)眼柄切除及相關(guān)指標(biāo)測(cè)定 試驗(yàn)蝦于實(shí)驗(yàn)室暫養(yǎng)7 d，待其活動(dòng)和攝食都正常后采用鑷燙法切除右側(cè)眼柄。切除過(guò)程如下：將醫(yī)用中號(hào)鑷子于酒精燈上燒至發(fā)紅狀態(tài)后對(duì)準(zhǔn)雌蝦右側(cè)眼柄進(jìn)行燙傷摘除，處理時(shí)間為35 s。分別于眼柄切除前（第0天）、切除后第1、7、15天隨機(jī)取10尾蝦，統(tǒng)計(jì)體長(zhǎng)、體重、卵巢重量、性腺指數(shù)（Gonadosomatic index，GSI）等指標(biāo)。

性腺指數(shù)=卵巢重量/體重×100%。

1.2.2 CaM及PMCA基因表達(dá)水平的測(cè)定 提取卵巢組織總RNA：活體解剖試驗(yàn)蝦，分離卵巢組織，稱重后立即采用TRIzolTM試劑（Invitrogen， USA）提取總RNA樣品，置-80 ℃保存待用。

采用iScript SYBR Green One-Step RT-PCR 試劑盒（Bio-Rad，USA），運(yùn)用實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)對(duì)各試驗(yàn)組克氏原螯蝦卵巢組織中CaM及PMCA基因表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè)。針對(duì)克氏原螯蝦CaM基因（GenBank登錄號(hào)：FJ179169）使用的檢測(cè)引物為：

5′-CAACGAAGTGGACGCTGAC-3′和5′-GGCTTCC

CTGATCTCTTCCT-3′，擴(kuò)增片段大小為103 bp；針對(duì)克氏原螯蝦PMCA基因（GenBank登錄號(hào)：AY455931）使用的檢測(cè)引物為：5′-GCAAGTGGTGG

CTGTAACTGGT-3′和5′-ATGGGCTTCAATTCTGG

ATATG-3′，擴(kuò)增片段大小為108 bp；內(nèi)參基因18 S rDNA使用的檢測(cè)引物為：5′-TGGTGCATGGCCGTT

CTTA-3′和5′-AATTGCTGGAGATCCGTCGAC-3′。實(shí)時(shí)定量PCR的操作按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，反應(yīng)條件均為：95 ℃ 預(yù)變性10 s；95 ℃變性30 s，60 ℃退火15 s ，共40個(gè)循環(huán)；最后72 ℃ 延伸10 min。反應(yīng)結(jié)束后設(shè)定閾值，利用SDS軟件V2.2版本輸出各檢測(cè)基因的Ct值；不同樣品CaM基因或PMCA基因與18 S rDNA基因Ct值的差值定義為ΔCt，設(shè)定表達(dá)量最低的試驗(yàn)組為基準(zhǔn)樣品（Calibrator），利用比較Ct值法（2-ΔΔCt法），最終獲得不同樣品與基準(zhǔn)樣品間基因表達(dá)量的比值。

2 結(jié)果與分析

2.1 眼柄切除前、后克氏原螯蝦體長(zhǎng)、體重及卵巢的變化

趙維信等[8]根據(jù)卵巢顏色變化、外觀特征、性腺指數(shù)等將克氏原螯蝦卵巢的發(fā)育過(guò)程分為5個(gè)時(shí)期，分別為：未發(fā)育期（Ⅰ期）、發(fā)育早期（Ⅱ期）、卵黃發(fā)生前期（Ⅲ期）、卵黃發(fā)生期（Ⅳ期）、成熟期（Ⅴ期）。依據(jù)此標(biāo)準(zhǔn)，于2012年1月對(duì)本研究取樣池塘進(jìn)行大量雌蝦隨機(jī)解剖檢測(cè)（共檢測(cè)120尾），結(jié)果表明取樣池塘中的雌蝦卵巢絕大多數(shù)處于發(fā)育Ⅱ期，個(gè)別處于發(fā)育Ⅲ期。因此，基本可認(rèn)為本研究所取40尾雌蝦的卵巢在單側(cè)眼柄切除前處于發(fā)育Ⅱ期。

由表1可知，從單側(cè)眼柄切除前至切除后的第15天，克氏原螯蝦雌蝦體長(zhǎng)和體重增長(zhǎng)不顯著，體長(zhǎng)由（13.5±0.4） cm增加至（14.2±0.7） cm，體重由（35.2±3.8） g增加至（40.5±6.8） g；相反，卵巢重量增加非常顯著（P<0.05），由（0.3±0.1） g增加至（1.9±0.6） g，從而使性腺指數(shù)由（0.9 ± 0.2）%增長(zhǎng)至（4.7±2.3）%，表明眼柄切除確實(shí)促進(jìn)了雌蝦卵巢的快速發(fā)育成熟。

觀察不同時(shí)間卵巢外觀特征可見(jiàn)：眼柄切除前卵巢呈白色至淺黃色，細(xì)線狀，卵粒少，無(wú)卵黃顆粒，處于發(fā)育Ⅱ期；眼柄切除后第1天卵巢呈淡黃色至黃色，線狀或條狀，出現(xiàn)卵黃顆粒，表明此時(shí)基本處于發(fā)育Ⅲ期；切除后第7天卵巢呈黃色至深褐色，棒狀，卵巢占據(jù)胸腔的1/2～3/4，卵黃顆粒大量生成，顯示此時(shí)處于發(fā)育IV期；切除后第15天卵巢呈深褐色至黑色，粗棒狀，占據(jù)整個(gè)胸腔，卵細(xì)胞圓形且飽滿，卵徑1.5 mm以上，卵黃顆粒充滿整個(gè)卵細(xì)胞，表明此時(shí)卵巢已發(fā)育成熟，處于發(fā)育V期。

2.2 眼柄切除前、后卵巢組織中CaM及PMCA基因表達(dá)水平的變化

由圖1可知，克氏原螯蝦雌蝦眼柄的切除均大幅誘導(dǎo)了卵巢組織中CaM及PMCA基因表達(dá)水平的上調(diào)，兩者在眼柄切除后的第1天表達(dá)水平最高，分別為眼柄切除前的8.7倍和13.2倍；隨后表達(dá)水平逐漸下降，切除后第7天CaM及PMCA基因表達(dá)水平分別為切除前的5.1倍和9.2倍；切除后第15天兩者幾乎回到了眼柄切除前的表達(dá)水平，分別僅為切除前的1.1倍和1.4倍。以上結(jié)果表明，CaM與PMCA可能主要參與眼柄切除誘導(dǎo)克氏原螯蝦卵巢成熟的早期分子過(guò)程。

3 討論

本試驗(yàn)中克氏原螯蝦雌蝦在單側(cè)眼柄切除后第15天卵巢已呈粗棒狀，顏色為深褐色至黑色，卵巢飽滿并占據(jù)整個(gè)胸腔，卵黃顆粒大且充滿整個(gè)卵細(xì)胞，核仁可見(jiàn)，表明此時(shí)卵巢已發(fā)育成熟。值得注意的是，雌蝦卵巢重量在眼柄切除后的第7天至第15天增長(zhǎng)最為顯著，由（0.8±0.3） g增長(zhǎng)至（1.9 ±0.6） g，表明此期間卵巢急速積累卵黃物質(zhì)（主要包括蛋白質(zhì)和脂類(lèi)）。從卵巢發(fā)育成熟時(shí)間上來(lái)看，切除眼柄雌蝦比不切除眼柄雌蝦卵巢成熟時(shí)間提早2～3個(gè)月[9]。

在克氏原螯蝦蝦苗人工繁育過(guò)程中，親蝦成活率低，產(chǎn)卵、孵化同步性差，育苗產(chǎn)量低等是目前制約克氏原螯蝦人工養(yǎng)殖的突出問(wèn)題[10]。在天然環(huán)境條件下，1齡幼蝦性腺發(fā)育需6～12個(gè)月達(dá)到成熟，雌雄發(fā)育基本同步。但是在人工養(yǎng)殖條件下，存在雌、雄蝦生長(zhǎng)和性腺發(fā)育不同步現(xiàn)象：雄性個(gè)體發(fā)育及性成熟明顯早于雌性，并且雄蝦精巢能自然成熟且精子質(zhì)量與野生蝦相比沒(méi)有顯著差異，可充當(dāng)親本；但是雌蝦卵巢常發(fā)生發(fā)育遲緩甚至停滯，即使在順利完成交配以后還需再發(fā)育2～5個(gè)月方可產(chǎn)卵。通過(guò)人工催熟的方法，如去除單側(cè)眼柄能在一定程度上促進(jìn)卵巢的發(fā)育成熟和批量排卵[6，11]，但在養(yǎng)殖生產(chǎn)實(shí)踐中常發(fā)現(xiàn)眼柄切除后易造成雌蝦蛻皮周期縮短、生長(zhǎng)受到抑制、死亡率上升等不良后果。因此，尋找促進(jìn)卵巢成熟的方法是經(jīng)濟(jì)蝦蟹類(lèi)人工飼養(yǎng)產(chǎn)業(yè)的長(zhǎng)期目標(biāo)。深入理解眼柄切除促進(jìn)卵巢成熟的分子機(jī)理是找到合理的、可替代方法的前提和基礎(chǔ)。

CaM是細(xì)胞內(nèi)鈣信號(hào)傳導(dǎo)途徑中的主要信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子，介導(dǎo)調(diào)控由Ca2+引起的一系列生理生化反應(yīng)，參與并調(diào)節(jié)細(xì)胞的增生、分化、運(yùn)動(dòng)等基本代謝過(guò)程；PMCA在細(xì)胞內(nèi)的主要作用是在信號(hào)刺激后做精細(xì)的排Ca2+掃尾工作，并長(zhǎng)效地維持靜息狀態(tài)下細(xì)胞內(nèi)的Ca2+濃度，受到CaM的正調(diào)控[12]。有研究報(bào)道，在大鼠、兩棲動(dòng)物及魚(yú)類(lèi)卵母細(xì)胞成熟的早期過(guò)程中，CaM通過(guò)與Ca2+結(jié)合而激活鈣調(diào)蛋白激酶（CaM kinase），導(dǎo)致細(xì)胞釋放促性腺素類(lèi)激素，從而促進(jìn)卵泡生長(zhǎng)以及雌二醇和孕酮的生成；卵泡細(xì)胞分泌產(chǎn)生的孕酮通過(guò)孕酮介導(dǎo)的卵母細(xì)胞成熟途徑活化細(xì)胞分裂周期蛋白2、周期蛋白B等卵母細(xì)胞成熟促進(jìn)因子（Maturation-promoting factors， MPFs）誘導(dǎo)卵母細(xì)胞發(fā)育成熟[13]。本研究利用實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)監(jiān)測(cè)CaM及PMCA基因在克氏原螯蝦眼柄切除前、后卵巢組織中表達(dá)水平的變化，結(jié)果顯示CaM及PMCA基因在眼柄切除早期被大量誘導(dǎo)表達(dá)，表明鈣信號(hào)通路可能也在甲殼動(dòng)物克氏原螯蝦卵巢發(fā)育成熟的早期過(guò)程中發(fā)揮重要作用。

克氏原螯蝦卵泡細(xì)胞中鈣信號(hào)通路的誘導(dǎo)激活推測(cè)是由體內(nèi)的促性腺激素釋放激素（Gonadotropin-releasing hormone，GnRH）類(lèi)似物引發(fā)的，因?yàn)镚nRH在哺乳動(dòng)物、兩棲動(dòng)物及魚(yú)類(lèi)中的主要功能是控制卵泡刺激素（FSH）和黃體生成素（LH）的釋放，在性別分化、性腺發(fā)育以及生殖過(guò)程中起重要調(diào)節(jié)作用[14]。克氏原螯蝦單側(cè)眼柄被切除后可能使得GnRH表達(dá)量上調(diào)，從而通過(guò)與卵泡細(xì)胞表面的GnRH受體結(jié)合進(jìn)而激活鈣信號(hào)通路。當(dāng)然，要最終明確鈣信號(hào)通路在克氏原螯蝦雌蝦眼柄切除后誘導(dǎo)卵巢成熟早期過(guò)程中的作用和調(diào)控機(jī)制，還需進(jìn)一步進(jìn)行深入研究探討，如可利用RNA干擾（RNA interference）技術(shù)抑制CaM的表達(dá)來(lái)研究其作用。

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收稿日期：2012-07-24

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31101331）；公益性行業(yè)（農(nóng)業(yè)）科研專項(xiàng)（201003070）；中央級(jí)公益性科研院所基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)

（2011JBFB02）；江蘇省自然科學(xué)青年基金項(xiàng)目（BK2012090）

作者簡(jiǎn)介：管政兵（1981-），男，湖南常德人，副教授，博士，主要從事生物化學(xué)與分子生物學(xué)相關(guān)研究工作，（電話）15061812230

（電子信箱）guanzhengbing@yahoo.com.cn。