轉基因動物研究的技術思路

摘要：從轉基因動物研究的目的出發，探討轉基因動物研究的不同思路，分析使用各種載體所考慮的基本出發點，說明受體動物遴選所需要考慮的因素，總結了轉基因方法的技術特點，提出轉基因動物檢測手段的設計原則，論述了轉基因動物繁殖的必要性，為從事轉基因動物方面的研究提供技術思路。

關鍵詞：轉基因動物；轉基因方法；技術思路

中圖分類號：Q789 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2012）21-4837-04

Technology Program of Transgenic Animal

LIU Xi-mei，QIAO Xian-feng，ZHANG Li-ping，CHENG Ni，BI Yan-zhen，LI Li，XIAO Hong-wei，

HUA Zai-dong，HUA Wen-jun

（Institute of Animal Husbandry and Veterinary Medicine， Hubei Academy of Agricultural Sciences /Hubei Key Lab of Animal Embryo and Molecular Breeding，Wuhan 430064，China）

Abstract： Different thoughts on the research of transgenic animal were discussed. It included the basic starting point and factors need to considered in the selection of various carriers and recipient animals， the summary of transgenic techniques， the design principles for transgenic animal detection， the necessity of transgenic animal breeding， etc. It provided a technical idea for the research of transgenic animals.

Key words： transgenic animal； transgenic technology； technical idea

轉基因動物制備的主要技術步驟包括目的基因的分離與克隆；表達載體的構建；受體細胞的獲得；基因導入；受體動物的選擇及轉基因胚胎的移植；轉基因整合表達的檢測；轉基因動物的性能觀測及轉基因表達產物的分離與純化；轉基因動物的遺傳性能研究以及性能選育；組建轉基因動物新類群等。30多年的轉基因動物研究歷程[1]，轉基因技術日新月異，轉基因動物的品種多種多樣，轉導的基因五花八門，涉及的領域超乎想象，遇到的問題層出不窮、千奇百怪。人們從初期的興奮、中期的熱血沸騰到現階段的冷靜思考，研究成果正步步趨近我們的生活。然而，在轉基因動物研究中總會遇到這樣或那樣的一系列棘手問題，有時因初始設計的缺陷，研究項目到中后期才察覺問題的嚴重性而不得不終止對該項目的研究，這是該類研究進入產業化艱難的重要原因之一[2]。為了省時省力，少走彎路，避免造成人力、物力、財力的巨大浪費，應選擇正確的設計思路、運用得當的方法，才能較好地完成轉基因動物研究工作。在此就轉基因動物研究的技術思路進行探討，以供參考。

1 研究的目的

轉基因動物研究及應用的目的決定其研究的總體方向，無論是以軍用還是民用發展為目的，轉基因動物研究總體可分為五大類型，即動物育種、動物生物反應器、觀賞寵物、醫學模型、基因功能研究等。不同類型的轉基因動物研究的技術思路不盡相同。

1.1 動物育種類

轉基因動物育種，特別是供應消費者肉、奶、蛋等之類的動物如牛、豬、雞、魚等的轉基因動物育種，其優先技術思路是無標記基因，如綠色熒光蛋白（GFP）、紅色熒光蛋白（RFP）、卡那霉素抗性（kan）、病毒載體骨架及相關的DNA片段等，這主要是考慮到產品的安全性評價問題，一旦帶有這類標記的動物形成，清除標記是非常費勁的工作，難以通過安全性評價。如帶有氨芐青霉素（amp）的轉基因動物抗藥性增加、帶GFP的轉基因動物過敏原增加；其次還需考慮基因功能如何發揮，如用促生長、抗病、環保、軍用（蜘蛛絲蛋白防彈衣）的基因，動物的生長極限、育種進度能否跟上病原進化的速度，環保及軍用產品的比較效益等，如抗瘋牛病的轉基因牛（敲除朊病毒蛋白基因的牛）的研究進程沒有瘋牛病病毒基因的變異快，將來培育的這種轉基因牛品種（10～15年后）無法確定能抗瘋牛病[3]；再者是考慮轉基因動物的生存及競爭安全，如在現有的生產模式下，轉基因動物能否在同類動物中正常生存（包括生長發育、繁殖、采食、抵抗力、攻擊與被攻擊等）及飼養的可控制性，其中典型的例子是轉基因魚因生長快速，使同類野生型魚的生存失去優勢而難以進入生態大環境，將導致野生魚生存空間越來越小；同時天敵掠走轉基因動物形成基因漂移也是潛在的風險。

1.2 動物生物反應器類

以動物生物反應器為目的的轉基因動物研究，由于其目的蛋白的附加值高，動物本身的剩余價值非常有限，動物的殘次值可以不予考慮。主要的技術思路：一是表達產物的結構，利用轉基因動物表達的絕大多數是蛋白質，這些蛋白質形成只有與原出處（天然細胞）結構一樣（一、二、三、四級結構）才有實際價值，否則試驗就不算成功。如轉基因豬表達的人血紅蛋白四級結構有偏差，攜氧量非常低，就未能達到預期的試驗目的[4]；表達的蜘蛛絲蛋白結構錯位，制成的防彈衣遠不如天然產物效果好[5]。二是表達量，這一指標常取決于將來的開發價值，一般pg、ng、μg級表達量基本沒有太大利用價值，但不表明越高越好，一旦過高，可能影響動物的正常生理生化及代謝，甚至危及生命，在動物能忍受的極限內則表達量越高越好。三是穩定表達，在轉基因動物表達穩定及個體表達差異較小時，初級產品的后加工相對簡單一些，如抽樣檢測、產品生產工藝等易于定型，如mg與g表達差異的其制備蛋白工藝相差甚遠，提取成本也將有明顯差異。四是時效性，對于不同類型的生物反應器，表達的時效性完全不同，如血液、尿液[3]、腹腔液、淚液等為終生表達產物，乳腺類的只在泌乳時乳汁里含有表達產物，雞蛋類只在產蛋后的雞蛋中有目的蛋白，精液類只在公畜性成熟后能檢測到表達產物。五是分離純化難易程度，按照產物的易得程度、重復使用性、產量高低、產物單位生產成本排序，優先順序是乳腺、雞蛋、尿液、精液、腹腔液、血液、淚液、組織臟器等；依終端產品提純成本排序，優先順序是尿液、精液、乳腺、雞蛋、腹腔液、淚液、血液、組織臟器等；根據初級產品的保存、運輸難易程度排序，優先順序是雞蛋、乳腺、精液、尿液、淚液、腹腔液、血液、組織臟器等。所有這些的前提是在立項前要考慮當地的生態是否適合所選的反應器類型，如在熱帶用奶牛乳腺作為生物反應器是不可取的方案，因為存在飼草非本地化、飼養成本高、初級產品牛奶儲運難等問題[1，6]。

1.3 觀賞寵物類

轉基因動物研制效率低，成本相對較高，所以培育觀賞及寵物類轉基因動物從技術思路上考慮動物來源較容易，觀賞價值較大，但要注意不能帶入新的過敏原和潛在病原，還需兼顧避免基因漂移。如轉基因有色猴、狗等不可帶入易傳染給人的疾病病原，轉基因花斑魚無意中進入不可控水系也是有風險的[7]。

1.4 醫學模型類

包括疾病模型和異種器官移植。前者技術限制比較少，只要轉基因動物能活、可控即可，一般技術思路是表型明顯，遺傳比較穩定，特殊情況下可以不考慮遺傳穩定問題，但一定要能代表目的疾病實際情況，目前小鼠作模型比較實用。而異種器官移植的技術思路比較復雜，一是與人器官的解剖、生理、代謝規律要相似，以便將來的器官能移植到人體內。二是要同時考慮兼顧動物育種和觀賞寵物類的技術特點。三是減少、避免人畜共患病，杜絕病原從轉基因動物器官傳染給人的途徑。四是要成本低，取材方便，易于飼養，又能建立SPF群體。綜合考慮，豬是比較好的候選對象[8]。

1.5 基因功能研究類

這類研究的技術思路是：一是快捷，即能在最短的時間內得到轉基因動物，并驗證功能。二是易于對轉基因個體進行檢測，可以通過標記、表型等建立可視化的檢測手段。三是雙等位轉（剔除）基因動物最理想，這種情況更能有效地驗證基因的功能。四是可重復性，由于功能驗證研究的轉基因動物不一定要遺傳穩定，甚至不需要傳代就能證明目的基因的功能，但試驗的可重復性是不可回避的，即在不同批次的試驗中能得到相同的結果。

2 載體

對于轉基因動物研究來說，載體是指進入動物細胞內有效的DNA或RNA，這與一般細菌轉化中的載體完全不同，在細菌中操作的那部分DNA片段對轉基因動物來說是非必需的，有時它還會影響轉基因的效果。一般技術思路是：一是用于原核注射、脂質體、磷酸鈣、電轉移的載體優先選無原核部分的完整表達框，即啟動子—目的基因—終止子，這一結構效率比較高，有效結構為裸DNA。二是體細胞克隆需要篩選標記來篩選陽性供體細胞，再加上完整的表達框，如果是定位整合或剔除載體還需定位區特定DNA片段和正負篩選標記，只有這樣才能達到定位的目的，有效結構多為裸DNA。三是病毒載體的病毒骨架和完整的表達框，有效結構多為包裝性載體，這類載體的整合效率較高，有些達到100%，常常通過包裝后，形成病毒顆粒而達到轉基因目的，整體結構包括缺陷病毒DNA和含目的基因的表達載體框兩部分，有時還有篩選標記、定位DNA片段等。四是其他方法中涉及到的特殊DNA片段也是必需的，如鋅指核酸酶（ZEN）、轉錄激活樣因子核酸酶（TALEN）等需要相應的DNA片段介導[2，6]。

3 受體動物

轉基因動物研究時，受體動物的遴選影響研究周期、投入大小、成功的幾率等。

按研究周期及投入計，其技術思路中動物排序的優先順序是斑馬魚、小鼠、豬、雞、羊、牛等動物；以基因功能驗證為主進行試驗時，斑馬魚最有效；以疾病及哺乳動物基因功能研究為主時，小鼠效率最高；而生物反應器的研究則以牛、羊的總效益最明顯。根據不同的用途，轉基因研究受體動物選擇的技術思路是：魚、鼠—基因功能驗證；鼠、豬—疾病模型；豬—異種器官移植；雞、豬、羊、奶牛—生物反應器，生產為軍用或民用特種蛋白；魚、雞、豬、羊、牛—農業育種，改善生產性能。各種轉基因動物的研究周期：魚為10 d，鼠為24 d，豬為121 d，雞為25 d，羊為156 d，牛為293 d[8，9]。

4 轉基因方法

根據載體及所轉基因動物的用途，轉基因方法的技術思路是：一是顯微注射法，該方法包括原核注射、BAC注射、YAC注射、染色體注射、微球注射等，其實質就是把DNA注射到動物的原核期胚胎中，這一方法的技術特點是能夠轉移任意大小的基因，即能夠轉導從小到大所有DNA，大到上千kb（千堿基），小至幾個bp（堿基），包括RNA等，只是該方法的效率低、成本高，但比較穩定，周期短。二是體細胞克隆法，以任何方式（脂質體轉、電轉、病毒轉等）將基因轉入體細胞，再通過體細胞克隆得到轉基因動物，該方法的技術特點是轉導的DNA片段大小有限，效率低，成本遠比顯微注射法高，陽性率高，原代個體常有生理異常出現。三是嵌合體法，包括胚胎干細胞、誘導多能干細胞（ips），其中胚胎干細胞方法在小鼠上應用比較成熟、穩定、應用廣泛，而ips方法雖已有成功的案例，但不穩定。嵌合體法在家畜上目前還處于研究階段，主要原因是建立家畜胚胎干細胞系很困難，這一方法的技術特點是原代為嵌合體，只有當生殖嵌合時，后代才能獲得轉基因動物。四是精子載體，包括DNA或病毒與精子孵育、精子與DNA共注射、睪丸及附睪注射DNA、精原干細胞轉導等，再通過受精產生轉基因動物，該方法的技術特點是操作簡單、成本低、大片段DNA無效、轉基因的效率不穩定。五是逆轉錄病毒法也稱反轉錄病毒法，用包裝好的帶目的基因的缺陷病毒感染胚胎、精子、個體、胚胎注射等，從而生產轉基因動物，這一方法的技術特點是轉基因效率高、不適于大片段的目的基因，病毒DNA片段的安全隱患難以徹底消除。分析公開的多種轉基因動物，多數是采用顯微注射、體細胞克隆或嵌合體方法，相比之下，精子載體和逆轉錄病毒法研究轉基因動物的文獻較多，但生產出能夠穩定傳代的轉基因動物不多[2，10]。

5 檢測手段

轉基因動物的檢測一般包括可視化識別、DNA整合、RNA轉錄和蛋白質翻譯、功能分析等檢測，即感官、分子細胞和功能3個水平的檢測[11]。

5.1 感官水平即可視化識別

在對目的基因表達載體設計時，常采用可以直觀分辨轉基因個體的元素，常用的有毛色、膚色、發光、藥物刺激表象、動作特征等。如能夠表達黑色標記的個體，在白色群體中黑色個體為陽性轉基因動物；帶有熒光（GFP、RFP等）標記的轉基因個體，在激發光刺激下會發出相應的熒光等；而藥物刺激表象、動作特征類型的僅有轉基因鼠個體出世，這類轉基因動物檢測比較容易，不需要試劑、藥品和專門的儀器設備，幼仔一出世就能很快鑒別，只是構建表達載體時需要設計特別的標記基因。在嵌合體轉基因方面，作為一種特殊的標記，膚色標記比較實用，如借助于轉基因ips細胞、胚胎干細胞等手段制備轉基因動物的研究中，使用黑色及棕色皮膚標記，小動物出世后，皮膚上有黑色或棕色斑塊，即為嵌合體轉基因個體，再通過繁殖后代，將得到純黑色或棕色的轉基因個體。這方面成功的例子實驗鼠比較多。

5.2 分子水平檢測

包含DNA、RNA和蛋白質。其中DNA檢測主要指整合檢測，可用PCR初步判斷，再用DNA印記雜交（Southern blot）確定，還可以結合其他檢測，如斑點雜交（Dot blot）和原位雜交等加以判斷；RNA和蛋白檢測屬于表達檢測，RNA分析可用反轉錄PCR（RT-PCR）初步檢測，RNA印記雜交（Northern blot）定性，RT-PCR結合定量PCR定量；蛋白質初步判斷用瓊脂擴散、酶聯免疫吸附測定（ELISA）等，定性以蛋白質印記雜交（Western blot）為基準加以判斷，免疫組化、放射免疫等可以作為參考。

5.3 功能水平檢測

這部分檢測比較復雜，不同的基因檢測手段各不相同，沒有參考和比較的價值，如異種器官移植的轉基因動物功能檢測就是直接用血清灌注器官研究其反應，細胞毒試驗直接用異原血清攻擊細胞研究細胞的形態結構變化，抗病轉基因動物直接用病毒攻擊探索其抗病的能力等。因此，功能水平檢測是檢驗轉基因動物的最后一關，一旦達到預期的功能——家畜生長快、異種器官能抵御排斥、反應器生產的藥物能治療疾病、帕金森病醫學模型出現癥狀等，這才是轉基因動物研究實質性成功的標志。

6 繁殖傳代

轉基因動物研究中，有些動物是可以繁殖傳代的，這說明外源的DNA整合到基因組中，同時也證明該轉基因動物繁殖機能正常，只有這樣轉基因動物才能進行育種。有些必須通過傳代才能得到真正意義上的轉基因動物，如嵌合體法得到的動物只能在后代中篩選整合外源基因的個體。特殊情況下，繁殖傳代不一定是必需的，如逆轉錄病毒感染胎鼠，只研究轉基因后的結果，不關心傳代問題[12，13]。

綜上所述，不難看出，研究轉基因動物不只是簡單把基因轉入動物的基因組中，而是要綜合考慮，從研究的目的、載體、動物、方法到檢測、傳代每個環節都需要仔細斟酌，建立適合研究者所需的轉基因動物技術路線，才能達到預期的研究目的。

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收稿日期：2012-03-26

基金項目：轉基因生物新品種培育專項（2011ZX08006-003、-002）；湖北省農業創新項目畜牧獸醫分項（2011-620-001-003）；重點實驗室開放

課題（2012ZD164）

作者簡介：劉西梅（1963-），女，陜西浦城人，副研究員，主要從事動物生物技術研究，（電話）027-87380647（電子信箱）anbit20@163.com。