不同來源沙門氏菌的分離鑒定及其耐藥譜型比較

摘要：利用亞硒酸鹽胱氨酸增菌液（SC）、沙門氏-志賀氏屬瓊脂培養基（SS）、科瑪嘉沙門氏菌顯色培養基、Reveal沙門氏菌檢測試劑盒和分子生物學方法對不同動物的糞便樣本進行沙門氏菌（Salmonella）的分離和鑒定。采用微量肉湯稀釋法對分離菌株進行恩諾沙星、安普霉素和氟苯尼考等17種抗菌藥物敏感性試驗，試驗數據采用 Whonet5.4軟件統計以比較不同來源沙門氏菌的分離率和耐藥譜型差異。結果表明，不同動物來源沙門氏菌的分離率和耐藥譜型差異較大，其中牦牛源沙門氏菌的分離率和耐藥率最低，禽源和犬源沙門氏菌的分離率差別不大，但耐藥譜型差異較大。

關鍵詞：沙門氏菌（Salmonella）；分離鑒定；耐藥譜型

中圖分類號：S852.61 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2012）21-4834-03

Isolation， Identification and Drug Resistance Spectrum Comparison of Salmonella from Different Sources

CHEN Chao-xi1，DU Xiong-wei2，SHI Zhi-hai3

（1. College of Life Science and Technology， Southwest University for Nationalities， Chengdu 610041，China；

2. College of Life Science and Technology， Dalian Nationalities University， Dalian 116600， Liaoning，China；

3. Insititute of Animal Husbandry and Veterinary Research， Henan Academy of Agricultural Science， Zhengzhou 450002，China）

Abstract： The Salmonella from manure samples of different animals were isolated and identified by use of selenite cystine enrichment broth（SC）， Salmonella-shigella agar（SS）， CHROM agar Salmonella colored medium， the Reveal Salmonella detection kit and molecular biological method. Microdilution broth method and Whonet5.4 software were used for antimicrobial susceptibility testing of the isolated strain to Enrofloxacin， Apramycin， Florfenicol and other 14 kinds of antimicrobial agents and the analysis on the isolation rates and drug resistance spectum in different sources of Salmonella. The results showed that there existed apparent differences in Salmonella isolation rates and drug resistance patterns from different animal origins. The isolation rate and drug resistance rate in Yak origin Salmonella were the lowest. The isolation rate between the Salmonella in avian and canine origin had no significant difference， but the drug resistance spectrum showed significant difference.

Key words： Salmonella； isolation and identification； drug resistance spectrum

沙門氏菌（Salmonella）是一種重要的人畜共患病原菌，其耐藥性問題日益嚴重，在抗生素持續壓力下甚至發生變異，以適應藥物的壓力環境，從而對人類的身體健康和畜牧業的持續發展造成嚴重危害。劉琴等[1]研究表明，沙門氏菌污染在一定程度上是由于農貿市場的衛生不良所致。張秀英等[2]的報道也表明，分離的沙門氏菌對鏈霉素的耐藥率達到50.0%以上。在法國，47%（118/252）患有低丙種球蛋白血癥的慢性或反復發作的腹瀉病人對賈第鞭毛蟲、彎曲桿菌屬和沙門氏菌更加脆弱易感[3]。本研究主要對不同動物的糞便樣本進行采集，利用SC增菌液、SS瓊脂、Reveal沙門氏菌檢測試劑盒和科瑪嘉沙門氏菌顯色培養基進行選擇性培養，同時采用分子生物學方法進行沙門氏菌毒力相關標志基因invE檢測，并對分離菌株進行藥物敏感性試驗，確定其對抗菌藥物的敏感性，比較不同動物來源沙門氏菌的耐藥譜型差異。

1 材料與方法

1.1 材料

菌株：53株沙門氏菌從2009年9月至2011年6月采集的不同動物（牦牛、禽類和犬）的699份糞便樣本中分離，大腸桿菌標準株ATCC25922由西南民族大學獸醫藥理學實驗室保存。

培養基，抗菌藥物，生化試劑：亞硒酸鹽胱氨酸增菌液（SC）、沙門氏-志賀氏屬瓊脂培養基（SS）和腸桿菌科生化編碼管購自成都培能醫療科技有限公司，科瑪嘉沙門氏菌顯色培養基購自鄭州博賽生物技術股份有限公司，Reveal沙門氏菌檢測試劑盒和分子生物學試劑購自寶生物工程（大連）有限公司。阿莫西林（Amo）、卡那霉素（Kan）、阿米卡星（Amk）、慶大霉素（Gen）、多西環素（Dox）、恩諾沙星（Enr）、左旋氧氟沙星（Lev）、利福平（Rif）、氟苯尼考（Flo）、多粘菌素（Pmb）、頭孢曲松（Cro）、頭孢噻肟（Ctx）、安普霉素（Apr）、磺胺嘧啶鈉（SD-Na）、土霉素（Otc）、鏈霉素（Str）和頭孢噻呋鈉（Cef）等17種抗菌藥物由成都中牧生物藥業有限公司饋贈。invE引物由寶生物工程（大連）有限公司合成。

1.2 方法

按照常規方法對不同動物的糞便進行樣本采集和處理，針對沙門氏菌分離難度較大的實際特點，本研究采用以下步驟進行。

1.2.1 SC增菌液增菌 用滅菌棉簽蘸取經處理的糞便樣本，放入加了6 mL SC增菌液的10 mL試管中，37 ℃培養16～24 h。

1.2.2 SS瓊脂分離培養 用接種環將可疑樣本接種至SS瓊脂培養基，37 ℃培養24～48 h。

1.2.3 科瑪嘉沙門氏菌顯色培養基培養 根據菌落在SS瓊脂上的生長情況，在不同時間點分別挑取單菌落在科瑪嘉沙門氏菌顯色培養基上劃線，培養時間維持24～48 h，進一步分離和純化沙門氏菌。

1.2.4 生化鑒定 對科瑪嘉顯色培養基上陽性和可疑陽性的菌落進行增菌培養后，按照腸桿菌科生化鑒定編碼管的說明進行生化鑒定。

1.2.5 Reveal沙門氏菌檢測試劑盒檢測 按照試劑盒說明書進行操作，主要步驟包括試劑的配制、沙門氏菌的增菌培養、試紙條測試和結果判讀幾個步驟。需要注意的是，各培養基的溶解過程中對溫度的要求不同，應嚴格按要求操作。

1.2.6 分子生物學鑒定 純化好的沙門氏菌增菌培養后進行DNA抽提，利用Prmier5.0設計相應invE引物[invE-F：TTTCCTGACCCCAGTGAT， invE-R： A（G/A）CGATAATGTTTTCCCAA]，按照以下程序進行常規PCR擴增（94 ℃ 10 min；94 ℃ 15 s，58 ℃ 15 s，72 ℃ 30 s，30個循環；最后于72 ℃延伸10 min），預計擴增片段大小為186 bp。

1.2.7 分離菌株的藥物敏感性試驗及耐藥譜型分析 參照美國臨床實驗室標準化委員會（National Committee for Clinical Laboratory Stands，NCCLS）推薦的微量肉湯稀釋法操作步驟進行[4]。利用Whonet5.4軟件對17種抗菌藥物進行耐藥水平分析，比較不同動物來源菌株的耐藥譜型差異。

2 結果

2.1 不同動物來源沙門氏菌的分離鑒定結果

試驗采用SC增菌液對沙門氏菌進行培養，能夠抑制其他腸道菌的過度生長。在SS瓊脂平板上大多數沙門氏菌為無色、透明菌落，部分菌株在菌落中央呈黑色或黑褐色。對SS上的可疑菌株同時采用沙門氏菌檢測試劑盒檢測、科瑪嘉顯色培養基培養和分子生物學鑒定，科瑪嘉顯色培養基上沙門氏菌為紫色或者淡紫色菌落，而沙門氏菌檢測試劑盒的陽性結果表現為試紙條的測試區有線性條紋，沙門氏菌毒力相關標志基因invE檢測結果如圖1所示，除第九泳道在SS上的可疑菌落經PCR檢測為陽性外，其他在SS上生長可疑的菌落經PCR檢測均表現陰性。

從采集的699份糞便樣本中共分離到沙門氏菌53株，其中牦牛源12株，禽源24株，犬源17株，分離率分別為5.19%、9.06%和8.37%，牦牛源沙門氏菌的分離率最低，而禽源和犬源沙門氏菌的分離率差別不大（表1）。

2.2 不同動物來源沙門氏菌的耐藥譜型分析

利用Whonet5.4軟件分別對不同動物來源的沙門氏菌進行不同藥物MIC50、MIC90和MIC范圍的計算，分析其耐藥譜型的差異。結果（表2）表明53株沙門氏菌中共有3株對試驗藥物均敏感，其中牦牛源2株，犬源1株，其余菌株對多粘菌素、阿米卡星和慶大霉素均敏感，對土霉素和鏈霉素均表現出不同程度的耐藥性。10株牦牛源沙門氏菌共有4種不同耐藥譜型表型，各表型菌株的數量差別不大；24株禽源沙門氏菌共有11種耐藥譜型，至少對3種以上的抗菌藥物耐藥；16株犬源沙門氏菌共有7種耐藥譜型，至少對4種以上的抗菌藥物耐藥。

3 小結與討論

3.1 沙門氏菌的分離鑒定

本研究利用亞硒酸鹽胱氨酸增菌液、沙門氏-志賀氏屬瓊脂培養基、Reveal沙門氏菌檢測試劑盒、科瑪嘉顯色培養基和分子生物學方法等對沙門氏菌進行分離鑒定。其中有以下幾點注意事項：（1）SC增菌液：在增菌中，SC培養液的添加量越大，對沙門氏菌的分離越有益，因為SC能有效地抑制糞便中其他腸道菌（包括革蘭氏陽性菌和部分革蘭氏陰性菌）的過度增長。（2）SS瓊脂：在劃線接種過程中，大多數沙門氏菌在瓊脂板上為無色透明的菌落，部分菌落的頂部有黑色斑點，但是試驗過程中發現有黑色斑點的菌落經PCR檢測出現陰性結果。（3）Reveal沙門氏菌檢測試劑盒：該方法快速準確，但需要注意的是在結果判讀時必須保證對照區有線條，同時不論測試區的線條密集程度如何，只要顯示線條就判定為陽性結果。（4）科瑪嘉顯色培養基：沙門氏菌在該培養基上主要生長為紫色菌落，如果部分菌株在24 h內沒有紫色或者淡紫色菌落生長，應適當增加培養時間至48 h。（5）分子生物學方法：本試驗采用分子生物學方法對沙門氏菌毒力相關標志基因invE進行檢測，結合其他培養基和試劑盒的使用，能夠保證沙門氏菌的準確分離和鑒定。

3.2 沙門氏菌的分離率和耐藥性分析

本試驗對不同動物的699份糞便樣本進行分離，共分離到沙門氏菌53株，分離率為7.58%，其中牦牛源、禽源、犬源的分離率分別為5.19%、9.06%和8.37%。與國內相關研究相比，其分離率除了比宋立等[5]的報道高外，均低于其他相關報道[1，6，7]。

本研究的藥敏試驗結果表明，53株分離菌中，除了2株牦牛源、1株犬源沙門氏菌對試驗藥物全部敏感外，其余分離菌株對土霉素和鏈霉素均表現出耐藥，而且除牦牛源沙門氏菌的耐藥水平較低外，禽源和犬源的耐藥譜型大多數超過4種抗菌藥物。國外相關研究也表明，分離的沙門氏菌至少對一種以上的抗生素耐藥，而且大多數菌株表現出多重耐藥現象[8，9]。這些提示我們，在獸醫臨床中沙門氏菌已呈現出不同程度的耐藥性，我們的后期工作是對分離的敏感株進行不同藥物的誘導，研究在不同抗菌藥物壓力下沙門氏菌的耐藥水平和耐藥譜型的變化規律，以及在不同誘導壓力下，沙門氏菌生物被膜形成能力及相關毒力基因和耐藥基因之間的相互關系，闡述不同因素之間的相關性。

參考文獻：

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[9] AARESTRUP F M， HENDRIKSEN R S， Lockett J， et al. International spread of multidrug-resistant Salmonella Schwarzengrund in food products[J].Emerg Infect Dis，2007，13（5）：726-731.

收稿日期：2012-03-15

基金項目：西南民族大學中央高校基本科研業務費專項資金學術梯隊建設工程項目（11NZYTD02）

作者簡介：陳朝喜（1980-），男，河南唐河人，講師，博士，主要從事獸藥殘留檢測及細菌耐藥機制研究，（電話）13980060375（電子信箱）

chaoxi8832@163.com。