桃葉橙資源篩選評(píng)價(jià)及分子鑒定

摘要：以湖北省地方特色柑橘桃葉橙為研究對(duì)象，開(kāi)展了資源調(diào)查、搜集及評(píng)價(jià)工作。從品質(zhì)分析角度闡述了當(dāng)前桃葉橙已經(jīng)成為一個(gè)品種群體，果實(shí)大小、種子數(shù)量和可溶性固形物含量等性狀變化較大，影響了桃葉橙的鮮食品質(zhì)，不利于桃葉橙產(chǎn)業(yè)未來(lái)的發(fā)展。通過(guò)測(cè)定并從中優(yōu)選了24份單株資源，并針對(duì)育種目標(biāo)進(jìn)行了資源分類(lèi)，為桃葉橙選育工作奠定基礎(chǔ)。AFLP分子鑒定從DNA水平充分證明了參試樣品發(fā)生了遺傳物質(zhì)的變異，同時(shí)也初步探明了各單株與桃葉橙8號(hào)、18號(hào)和139號(hào)的遺傳進(jìn)化關(guān)系。

關(guān)鍵詞：桃葉橙；資源；評(píng)價(jià)；鑒定

中圖分類(lèi)號(hào)：S666.4 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2012）21-4823-04

Diversity Assessment of Taoye Orange （Citrus sinensis （Linn.） Osbeck cv. Taoye Cheng） Germplasm Resources and Molecular Characterization Using AFLP Markers

HE Li-gang1，JIANG Ying-chun1，WU Li-ming1，XU Miao1，TONG Zhu1，WANG Zhi-jing1，SUN Zhong-hai1，

WU Shu-yong2，CUI Xu-dong3

（1. Institute of Fruit and Tea， Hubei Academy of Agricultural Sciences， Wuhan 430209，China；

2. Local Specialty Service Center in Zigui County， Yichang 443600，China；

3. Production and Marketing Professional Cooperatives for Taoyecheng Orange in Quyuan Town of Zigui County，Yichang 443604，Hubei，China）

Abstract： Taking taoye orange as the research object， evaluation analysis on fruit quality showed that the range of fruit size， seed number and content of total soluble solid altered widely in Taoye orange， reduced the fresh food quality and contributed negatively to the development of Taoye orange industry. In addition， 24 germplasm resources were selected as candidates and classified into five classes for future selection according to breeding objectives. The results of AFLP analysis revealed the relationship between individual and No. 8， No. 18， or No. 139， and suggested that a genetic variation had happened definitely in selected germplasm resources.

Key words： Taoye orange； germplasm； diversity assessment； AFLP

桃葉橙原產(chǎn)于湖北省秭歸縣屈原鎮(zhèn)龍馬溪村低山地，由于其春梢葉片呈披針形，狹長(zhǎng)似桃葉，故命名為桃葉橙。自20世紀(jì)60年代開(kāi)始，湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院果樹(shù)茶葉研究所就已開(kāi)展了桃葉橙的相關(guān)研究工作。典型桃葉橙果實(shí)果形端正，果面橙紅光滑，臍部有印圈，果肉橙黃，皮薄子少，濃甜質(zhì)脆，汁多化渣，富玫瑰香氣，具有甜、香、脆的獨(dú)特風(fēng)味，鮮食品質(zhì)極佳[1]。由于其品質(zhì)的優(yōu)越性，桃葉橙與臍橙、夏橙并譽(yù)為“峽橙三秀”，曾是中國(guó)柑橘三大地方良種之一。

20世紀(jì)80年代，桃葉橙是秭歸縣重點(diǎn)推廣和發(fā)展的柑橘良種，在秭歸縣境內(nèi)各柑橘產(chǎn)區(qū)廣泛栽培。然而，20世紀(jì)90年代臍橙引種成功，導(dǎo)致桃葉橙種植面積逐漸萎縮；同時(shí)，由于三峽庫(kù)區(qū)蓄水工程的順利推進(jìn)，原有桃葉橙優(yōu)良單株和桃葉橙豐產(chǎn)園均被淹沒(méi)。其次，原產(chǎn)地栽培品種混雜，管理措施相對(duì)落后，影響了桃葉橙原有優(yōu)良品質(zhì)的發(fā)揮，導(dǎo)致果實(shí)大小參差不齊，種子偏多，品質(zhì)下降，嚴(yán)重阻礙了桃葉橙商品化的生產(chǎn)[2，3]。因此，桃葉橙在市場(chǎng)競(jìng)爭(zhēng)中處于劣勢(shì)，受市場(chǎng)影響原產(chǎn)地農(nóng)戶(hù)也出現(xiàn)拋棄桃葉橙改種臍橙的現(xiàn)象，一定程度上更加速了桃葉橙種植面積的下滑和桃葉橙產(chǎn)業(yè)的衰落。基于桃葉橙產(chǎn)業(yè)的發(fā)展現(xiàn)狀，擬通過(guò)對(duì)搜集到的桃葉橙群體資源進(jìn)行品質(zhì)測(cè)定，并進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)分析，以篩選出果大、少核或無(wú)核和高糖低酸的候選單株，輔以AFLP分子標(biāo)記技術(shù)進(jìn)行遺傳變異鑒定，從基因水平進(jìn)一步確定桃葉橙優(yōu)變單株，從而充分發(fā)揮桃葉橙特色資源優(yōu)勢(shì)和文化優(yōu)勢(shì)，為桃葉橙提純選優(yōu)、新品種選育及桃葉橙產(chǎn)業(yè)的發(fā)展奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

2009年和2010年連續(xù)兩年在秭歸縣屈原鎮(zhèn)廣泛開(kāi)展桃葉橙資源調(diào)查，單株編號(hào)，并采集樹(shù)體中上部不同方位果實(shí)15個(gè)以上，待測(cè)。針對(duì)2009年和2010年入選復(fù)選的優(yōu)良單株，依據(jù)編號(hào)隨機(jī)采集樹(shù)體外圍無(wú)病蟲(chóng)危害的幼嫩葉片，液氮速凍后

-80 ℃保存用于AFLP分子鑒定。

1.2 品質(zhì)測(cè)定

稱(chēng)取15個(gè)以上果實(shí)，計(jì)算單果重；分別用直尺一次性量取15個(gè)以上果實(shí)縱徑和橫徑，計(jì)算果形指數(shù)；描述果實(shí)色澤（橙紅、橙黃、黃）和香氣有無(wú)；一次性切取5個(gè)以上果實(shí)，描述風(fēng)味（甜酸、適中、酸甜）；測(cè)定5個(gè)果實(shí)赤道面皮厚，計(jì)算單果皮厚，并統(tǒng)計(jì)種子數(shù)量；采用糖度數(shù)顯折射儀DRB0-45 （購(gòu)自上海測(cè)維光電技術(shù)有限公司）測(cè)定果實(shí)可溶性固形物含量；可滴定酸含量測(cè)定采用酚酞指示劑法，VC含量測(cè)定采用2，6-二氯靛酚滴定法[4]。

1.3 DNA的提取

桃葉橙葉片基因組DNA提取采用改良CTAB法[5]。最后用30～50 μL TE緩沖液溶解沉淀，并于0.8%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行質(zhì)量檢測(cè)。

1.4 AFLP分析

AFLP分析中所采用的引物及接頭序列見(jiàn)表1，其中E 和M 分別表示EcoRⅠ系列引物和MseⅠ系列引物，具體操作流程參考文獻(xiàn)[6]。酶切連接反應(yīng)體系為25 μL，DNA底物為200 ng，EcoRⅠ和MseⅠ各2 μL，接頭1 μL，10 mmol/L ATP 2.5 μL，T4 DNA連接酶1 μL，瞬時(shí)離心混合后37 ℃溫育5 h，8 ℃繼續(xù)保溫4 h，4 ℃過(guò)夜。預(yù)擴(kuò)增采用25 μL反應(yīng)體系，DNA模板2 μL，預(yù)擴(kuò)增引物1 μL，dNTPs 0.5 μL，Taq聚合酶0.5 μL，瞬時(shí)離心數(shù)秒，擴(kuò)增參數(shù)：94 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸80 s，30個(gè)循環(huán)。預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物采用TE稀釋20倍，取2 μL作為選擇性擴(kuò)增模板，選擇性擴(kuò)增引物1 μL，dNTPs 0.5 μL，Taq聚合酶0.5 μL，加入ddH2O至25 μL，瞬時(shí)離心數(shù)秒混勻，第一輪擴(kuò)增參數(shù)：94 ℃變性30 s，65 ℃退火30 s，72 ℃延伸80 s，以后每輪循環(huán)溫度遞減0.7 ℃，12個(gè)循環(huán)；第二輪參數(shù)：94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸80 s，23個(gè)循環(huán)。擴(kuò)增產(chǎn)物加入10 μL Loading Buffer 混勻，95 ℃變性，4%聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)。

1.5 數(shù)據(jù)處理

品質(zhì)測(cè)定結(jié)果導(dǎo)入Excel軟件中，計(jì)算單果重、果形指數(shù)、皮厚以及可滴定酸和VC含量，采用SAS 9.2軟件對(duì)計(jì)算結(jié)果進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)差和變異系數(shù)的統(tǒng)計(jì)分析。AFLP分析中獲得的DNA譜帶進(jìn)行數(shù)字化統(tǒng)計(jì)，有帶的位置計(jì)為1，無(wú)帶的位置計(jì)為0，將統(tǒng)計(jì)結(jié)果輸入Excel表格中，利用NTSYS pc 2.10e數(shù)據(jù)分析軟件進(jìn)行聚類(lèi)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 桃葉橙資源評(píng)價(jià)

2009年和2010年分別測(cè)定29份和44份桃葉橙單株果實(shí)樣品。室內(nèi)測(cè)定結(jié)果發(fā)現(xiàn)，桃葉橙果實(shí)色澤橙紅，普遍具有香氣，風(fēng)味酸甜為主，汁多化渣。表2和表3統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果表明，桃葉橙果實(shí)單果重89.00～205.40 g，變異系數(shù)2009、2010年分別為14.56%、14.99%，性狀表現(xiàn)參差不齊；種子數(shù)變化大，變化范圍0.70～15.70粒，變異系數(shù)2009年、2010年分別為39.87%、53.47%，極不穩(wěn)定，影響鮮食品質(zhì)；可溶性固形物含量變化相對(duì)較小，最低11%，最高可達(dá)14%，變異系數(shù)2009、2010年分別為6.28%、4.67%；可滴定酸含量也有較大幅度變化，變異系數(shù)2010年達(dá)40.36%；此外，果皮厚度變異也比較嚴(yán)重。根據(jù)大果、少核或無(wú)核和高糖等選育目標(biāo)，2009年7份、2010年17份入選復(fù)選（表3、表4），并初步確定WGH-01、DYL-63和WSF-40作為重點(diǎn)候選優(yōu)株，進(jìn)入優(yōu)良性狀遺傳穩(wěn)定性觀察階段。為儲(chǔ)備桃葉橙特色育種資源，對(duì)入選優(yōu)株進(jìn)行資源分類(lèi)，結(jié)果見(jiàn)表5。

2.2 AFLP聚類(lèi)分析

對(duì)2009～2010年參選的桃葉橙資源中的23份單株進(jìn)行AFLP分子鑒定發(fā)現(xiàn)，64對(duì)通用引物中引物對(duì)E-ACT/M-CAA、E-ACT/M-CTT、E-ACC/M-CAA、E-ACG/M-CAA、E-AGC/M-CAA和E-AGC/M-CAC能夠?qū)⒋蟛糠謽悠穮^(qū)別開(kāi)。其中，以桃葉橙雜交父本金水柑為外部對(duì)照，桃葉橙各單株（包括雜交親本及子代）在相似系數(shù)為0.28～0.67水平上聚類(lèi)（圖1），3株桃葉橙候選優(yōu)株中，WSF-40和DYL-63與18號(hào)較為臨近，與8號(hào)相距較遠(yuǎn)，說(shuō)明WSF-40和DYL-63可能為18號(hào)營(yíng)養(yǎng)系后代；WGH-01為139號(hào)營(yíng)養(yǎng)系后代，與18號(hào)、8號(hào)差別均比較明顯，聚類(lèi)分析充分證明了這一觀點(diǎn)。

3 小結(jié)

以柑橘地方特色品種秭歸桃葉橙作為研究對(duì)象，旨在為重振桃葉橙產(chǎn)業(yè)奠定理論基礎(chǔ)。桃葉橙在原產(chǎn)地具有深厚的群眾基礎(chǔ)和文化底蘊(yùn)，在市場(chǎng)經(jīng)濟(jì)飛速發(fā)展的今天，充分挖掘和利用資源優(yōu)勢(shì)，有利于桃葉橙產(chǎn)業(yè)的復(fù)蘇和壯大。擁有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的品種是市場(chǎng)競(jìng)爭(zhēng)的核心，發(fā)展桃葉橙產(chǎn)業(yè)必須具有性狀優(yōu)良的桃葉橙品種（系），針對(duì)這一目標(biāo)，開(kāi)展了廣泛的資源調(diào)查、搜集及評(píng)價(jià)工作，并且初步確定桃葉橙品種（系）候選優(yōu)株，然而由于桃葉橙目前在原產(chǎn)地栽培環(huán)境復(fù)雜，多為小范圍種植，資源搜集難度較大，群體的覆蓋率難以保證；其次，大多數(shù)單株資源僅采用一年的試驗(yàn)數(shù)據(jù)，其遺傳穩(wěn)定性還有待連續(xù)的觀察和研究。

AFLP分子鑒定分析中，雖然將大部分樣品區(qū)別開(kāi)，但是對(duì)于桃葉橙8號(hào)、18號(hào)和139號(hào)的進(jìn)化關(guān)系仍不明確，根據(jù)記載，18號(hào)來(lái)源于8號(hào)，聚類(lèi)分析圖中可以說(shuō)明這一點(diǎn)，然而139號(hào)為18號(hào)的營(yíng)養(yǎng)系后代，聚類(lèi)分析沒(méi)有反映這一點(diǎn)，這可能與分子鑒定過(guò)程中篩選的引物數(shù)量有關(guān)，由于僅采用了6對(duì)引物，無(wú)法覆蓋全部基因組，不能客觀反映基因組序列中所有的差異位點(diǎn)，通過(guò)增加篩選引物組合數(shù)量可以緩解。

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收稿日期：2012-03-16

基金項(xiàng)目：湖北省研究與開(kāi)發(fā)項(xiàng)目（2011BBB049）；湖北省農(nóng)業(yè)科技創(chuàng)新中心資助項(xiàng)目（2007-620-001-03）；湖北省農(nóng)科院果茶所青年科學(xué)基金

項(xiàng)目（GCJJ201203）

作者簡(jiǎn)介：何利剛（1982-），男，湖北羅田人，助理研究員，博士，主要從事果樹(shù)生物技術(shù)育種和抗寒分子機(jī)理研究，（電話）027-87988653

（電子信箱）lghe44@yahoo.com.cn；通訊作者，蔣迎春，研究員，（電話）027-87989513（電子信箱）jyc6512@yahoo.com.cn。