大孔樹脂吸附提取農抗702的研究

摘要：為了探索大孔樹脂對農抗702吸附的有利條件，以濃縮液及不同吸附樹脂為試驗材料，對吸附及解吸過程進行單因素試驗，結果表明：①以HP-10樹脂作為吸附劑，飽和吸附量為947 μg/g；②最佳吸附pH為8.0，當吸附進行到10 h之后其飽和吸附量基本保持在945 μg/g左右，當動態吸附時其流速為1.5 mL/min時既有利于吸附又可縮短周期。

關鍵詞：鏈霉菌702；農抗702；大孔樹脂；抗真菌活性；吸附量

中圖分類號：TQ321；R284.2 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2012）21-4787-03

Study on Extraction of Agricultural Antibiotic 702 by Macroporous Resin

LI Han-guang1，2，ZHOU Qiu-xiang3，TU Guo-quan1

（1.College of Bioscience and Engineering，Jiangxi Agricultural University，Nanchang 330045，China；2. School of Biotechnology， Jiangnan University， Wuxi 214122， Jiangsu， China； 3. Affiliated Hospital of Jiangxi Agricultural University， Nanchang 330045，China）

Abstract： In order to probe the favorable conditions for macroporous resin to absob agricultural antibiotic 702， taking concentrate and different absorption resins as experimental materials， single-factor experiments of the absorption and desorption process were conducted. The results were as followed，①When taking the HP-10 resin as absorbents， the saturated extent of absorption was 947 μg/g. ②The best absorption pH was 8.0， after ten hours absorbing， the saturated extent of absorption was staying at about 945 μg/g. And when the vs of dynamic absorption was 1.5 mL/min， it was of great help to absorption as well as shorten the cycle.

Key words： Streptomycin 702； agricultural antibiotic 702； macroporous resin； antifungal activity； adsorption capacity

江西農業大學生物科學與工程學院應用微生物研究室從土壤中篩選得到鏈霉菌702，以其作為出發菌株，經誘變處理后得到一高產菌株，其發酵液中可分離得到抗真菌的抗生素活性物質，其活性成分命名為農抗702[1-4]。本試驗探索運用大孔吸附樹脂來分離純化農抗702，篩選出合適的樹脂，確定適宜的吸附條件，通過樹脂吸附法得到農抗702的固體結晶，并對結晶固體作進一步分析檢測，為確定其純度及化學結構作一些前期的探討。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 試驗設備及儀器 Waters XT erraTM RP18 （5 μm，3.9 mm×150 mm）分析柱、3 cm×120 cm玻璃層析柱、TU-1901型紫外可見分光光度計、低速大容量多管離心機、旋轉蒸發器等。

1.1.2 主要試劑 不同型號的大孔網格樹脂柱層析（購于上海亞東核級樹脂有限公司），HCl、NaOH、乙醇、甲醇等均為分析純試劑。

1.2 試驗方法

1.2.1 大孔樹脂的預處理方法[5，6] 工業級新樹脂使用前必須進行預處理，以除去樹脂中所含有的少量低聚物、有機物及有害離子。裝柱前先清洗設備及管道，以防有害物對樹脂的污染，并排凈設備內的水。先于吸附柱內加入相當于裝填樹脂體積0.4～0.5倍的乙醇，然后將新樹脂投入柱中，使其液面高于樹脂層，浸泡24 h。用乙醇或甲醇，以2 BV/h的流速通過樹脂層，并浸泡4～5 h。再用乙醇以2 BV/h的流速通過樹脂層，洗至流出液不呈白色渾濁為止，并用蒸餾水以同樣流速洗凈乙醇。用2 BV的5%HCl溶液，以4～6 BV/h的流速通過樹脂層，并浸泡2～4 h，然后用蒸餾水以同樣的流速洗至流出液pH中性。用2 BV的2%NaOH溶液，以4～6 BV/h的流速通過樹脂層，并浸泡2～4 h，然后用蒸餾水以同樣的流速洗至流出液pH中性。

1.2.2 標準曲線的測定 因前期試驗證明Natamycin與農抗702理化性質基本一致，故本試驗以Natamycin作為農抗702抗真菌活性成分標準品。取Natamycin標準母液用蒸餾水稀釋成40、50、60、70、80 μg/mL等不同濃度；以橘青霉為指示菌，應用管碟法進行生物學效價測定；同時每個樣品平板中放置20 μg/mL Natamycin的牛津杯進行測定，以求得每批樣品抑菌圈平均校正值，以抑菌圈直徑校正值的平方為橫坐標，以Natamycin溶液濃度（C）的對數為縱坐標作圖，如圖1。

圖1說明生物檢測法在Natamycin的質量濃度為40～80 μg/mL范圍內具有良好的線性。因此，可以采用該方法進行鏈霉菌702抗真菌組分含量的計算。

1.2.3 吸附樹脂的選擇[7，8] 根據農抗702抑真菌組分的性質，選取了XAD7HP、XAD18、DA201、SIPI21、HP10 5種大孔樹脂進行吸附試驗，按樹脂前處理方法分別對其進行處理，分別取5.0 g處理好的濕樹脂5份與濃縮液（因原發酵液效價較低，故在做樹脂吸附前進行初步濃縮，下同）按1∶10比例置于250 mL三角瓶中，在室溫條件下進行靜態吸附，200 r/min，24 h后用濾紙過濾并用50.0 mL無菌水沖洗樹脂得余液，余液用無菌水稀釋5倍；取同批5.0 mL濃縮液用無菌水稀釋20倍作對照，以確定原濃縮液效價單位；以Natamycin作對照抗生素、以橘青霉為指示菌按劑量法測其效價，重復3次，比較不同吸附樹脂的吸附量大小，以確定最佳吸附樹脂。

Q=[（C0-C1）×V]÷m

式中，Q為樹脂的吸附量（μg），C0為發酵液濃度（μg/mL），C1吸附后余液濃度（μg/mL），V為發酵液體積（mL），m為濕樹脂重量（g）。

1.2.4 最佳吸附條件的研究

1）最佳吸附pH的確定[9]。采用靜態吸附法觀察不同pH對吸附的影響。以HP-10為吸附樹脂，取5.0 g濕樹脂7份，置于250 mL三角瓶中，用pH2.2～9.0的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液分別把濃縮液的pH調成5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0，按1∶10比例加入放有樹脂的三角瓶中，室溫條件，200 r/min進行靜態吸附，24 h后用濾紙過濾樹脂并用50.0 mL無菌水沖洗樹脂得余液，余液用無菌水稀釋5倍；另取同批5.0 mL濃縮液用無菌水稀釋10倍作對照，以確定原濃縮液效價單位；以1.2.3方法測其效價，重復3次，以比較在不同吸附pH條件下樹脂的吸附量大小。

2）最佳吸附時間的確定。取50.0 mL濃縮液若干等份，各置于250 mL三角瓶中，用pH2.2～9.0的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液把濃縮液pH調至8.0，于2、4、6、8、10、12、16、20、24 h用濾紙過濾樹脂并用50.0 mL無菌水沖洗樹脂得余液，另取同批5.0 mL濃縮液用無菌水稀釋20倍作對照，以確定原濃縮液效價單位；以1.2.3方法測其效價，重復3次，以比較在不同吸附時間條件下樹脂的吸附量大小。

3）最佳流速確定。采用動態吸附的方法考察不同流速對吸附的影響[10]。以HP-10為吸附劑，把2.0 g樹脂裝入10 mm×20 cm的柱內，用pH2.2～9.0的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液將樣品pH調至8.0，室溫條件下分別以1.0、1.5、2.0 mL/min 3種速度通過樹脂層。以每5.0 mL為一個單位進行收集，分別檢測泄漏率，以比較在不同吸附流速條件下樹脂的泄漏率大小。

泄漏率=單個收集單元的效價/702樣品初始效價×100%

2 結果與分析

2.1 不同大孔樹脂對農抗702的吸附量

濃縮液經不同大孔樹脂吸附處理后，以生物法進行效價測定，其效價檢測結果見表1。從表1可以看出：所選用的5種大孔吸附樹脂對農抗702所產抗真菌活性物質均有較好的吸附效果，每克吸附量均在867 μg以上，其中HP-10吸附效果最好，每克樹脂可吸附947 μg，最終選用HP-10樹脂作為鏈霉菌702所產抗真菌活性物質的吸附劑。

2.2 最佳吸附條件試驗結果

2.2.1 最佳吸附pH 使用大孔樹脂吸附弱電解質時，由于pH直接影響被吸附物的解離度而影響吸附量，且大多數抗生素多為弱堿性物質，理論上在堿性條件下有較好吸附效果，但考慮到農抗702的穩定性，選用pH 5.0～8.0條件下測定樹脂的吸附量。

從圖2可以看出，濃縮液在pH 5.0～8.0的范圍內都有較高的吸附量，其中pH 8.0的條件下吸附量最高，達964 μg/g，略高于自然條件下947 μg/g的飽和吸附量，進一步說明HP-10樹脂的飽和吸附量為945 μg/g左右，由于濃縮液的pH一般7.0左右，所以一般可選用pH 8.0或自然條件下進行吸附。

2.2.2 最佳吸附時間 濃縮液在不同吸附時間處理后，以生物法進行效價測定，其效價檢測結果見圖3。由圖3可以看出，當把樹脂投進濃縮液，活性物質能很快被HP-10樹脂所吸附，當樹脂吸附時間達到10 h以后吸附量變化不大，達到了飽和吸附量，所以樹脂的吸附飽和時間可以確定為10 h。

2.2.3 最佳吸附流速 從圖4可以看出，以1.0 mL/min的流速通過層析柱時，其泄漏曲線在下方。而以2.0 mL/min的流速通過柱時，其曲線在最上方，說明較低的流速有利于農抗702的吸附，原因在于流速較慢時，農抗702與樹脂接觸時間延長，有利于其從液相擴散到固相（即樹脂相），從而提高了吸附率；流速加快，泄漏率增加。由于1.0 mL/min流速太慢，在生產中會增加成本，而又因為農抗702活性成分濃度較低而且處理量較大，綜合考慮后，選用1.5 mL/min的吸附流速。

3 小結與討論

該試驗從樹脂選型、吸附時間、吸附pH及吸附流速等方面對農抗702抗真菌活性成分的吸附條件進行優化，得出如下結論：

1）在大孔樹脂選型中，以非極性的HP-10樹脂作為吸附劑效果較好；

2）優化后的吸附條件為：pH 8.0，吸附流速為1.5 mL/min，吸附時間10 h；

3）該試驗為進行一步純化農抗702提供了較為合理的大孔樹脂吸附工藝路線，但由于時間及試驗條件的限制，有關活性物質分離純化的其他工藝路線還有待進一步的研究。

參考文獻：

[1] 熊智強，徐 平，武 琳，等.鏈霉菌702產孢子固體培養基和培養條件的篩選[J].生物數學學報，2008，23（3）：563-568.

[2] 徐 平.放線菌素x-2高產菌株的抗藥性致死突變標志的誘變篩選研究[J].江西農業大學學報（自然科學版），2006，28（1）：123-125.

[3] 蔡華靜，文 英，涂國全.鏈霉菌702所產活性物質穩定性測定研究[J].江西農業大學學報（自然科學版），2003，25（6）：929-933.

[4] 周 云，張智平，涂曉榮，等.農抗702抗真菌活性的測定[J].江西農業大學學報（自然科學版），2009，31（6）：1127-1133.

[5] 何炳林.吸附與吸附樹脂[J].石油化工，1977，6（3）：263.

[6] 鄧 亮，葉利明，侯世祥.苯乙烯型大孔吸附樹脂預處理的質量評價方法研究[J].中國中藥雜志，2004，29（11）：1037.

[7] 董新昕，姜紹通，潘麗軍.茶多酚吸附分離工藝中吸附劑及洗脫劑的優選[J].合肥工業大學學報（自然科學版），2002（Z1）：811-814.

[8] 劉訓理，崔 云，衣海青，等.樹脂法提取農抗S-921研究[J].山東農業大學學報，1996，27（3）：1-6.

[9] 俞俊堂，唐孝宣.生物工藝學[M].上海：華東理工大學出版社，1991.384-385.

[10] 許 亮，師俊玲，陳志娜，等.大孔樹脂分離純化寧夏枸杞總黃酮的研究[J].離子交換與吸附，2011，27（3）：202-211.

收稿日期：2011-12-27

基金項目：江西省科技支撐計劃項目[贛科發計字（2007196號）]

作者簡介：李漢廣（1978-），男，江西九江人，講師，在讀博士研究生，研究方向為生物化工及微生物育種，（電話）0791-83813459（電子信箱）

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