SSR鑒定水稻兩系雜交種純度的運用與探討Ⅳ.不同品種同一引物檢測試驗

摘要：根據引物篩選結果，選出9個均可用SSR引物RM17檢測純度的兩系雜交稻品種，通過室內鑒定判斷品種間的分子學差異。同時通過田間正季鑒定判斷品種間的植物學特征差異，探討SSR引物的分辨力和可靠性。結果表明，當遺傳背景較近的品種相互混雜時，用單對引物不能有效區分。

關鍵詞：兩系雜交稻；SSR；不同品種；同一引物；純度鑒定；比對

中圖分類號：S511；Q789 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2012）21-4720-02

Study on Detection of Seed Purity of Two-line Hybrid Rice by Simple Sequence Repeat （SSR）Ⅳ. Experiments of Detecting Different Varieties by Same Primer

ZHAO Hong1，ZHANG Yu-fei1，LIN Mei1，LIAO Fang-li1，XIONG Xian-feng1，TU Shu-xin2，ZHANG Kai3

（1.Seed Administration Bureau of Jingzhou，Jingzhou 434020，Hubei，China；2. Huazhong Agricultural University，Wuhan 430070，China；

3.College of Agriculture，Yangtze University，Jingzhou 434025，Hubei，China）

Abstract： According to primer sorting results， seeds of 9 two-line hybrid rice varieties of which the purity could be detected by SSR marker RM17 were chosen to identify their molecular differences by laboratory tests. At the same time， the discretion and dependability of SSR methods was evaluated by the morphological and biological differences in the field. It was concluded that varieties with similar genetic background could not be distinguished by only one pair of primer.

Key words： two-line hybrid seeds； different varieties； one pair of primer； purity identity； alignment

利用SSR分子標記鑒定兩系雜交稻種子純度，具有快速、穩定、重復性好、多態性明顯的優點，是現在室內鑒定種子純度應用最廣泛的分子標記方法。該方法一般是從大量的引物中篩選出多態性高、共顯性強，雙親譜帶清晰的1對引物，然后用這1對引物來鑒定雜交稻種子的純度[1-7]。但是往往1對引物對多個品種都具有多態性，且符合引物篩選的標準，就意味著1對引物可用于多個品種的純度鑒定，這為篩選引物和鑒定品種提供了方便?？墒侨绻@些品種之間發生了混雜，用目前的方法是否也能發現并得到準確的純度鑒定結果卻鮮見報道[1，8，9]。為了探討同一引物對不同品種間混雜株的分辨率，判斷單對SSR引物測定兩系雜交稻種子純度的準確性和可靠性，特開展此試驗。

1 材料與方法

1.1 材料

本試驗共用9個雜交稻品種做材料，其中天兩優616、兩優17、苯兩優639 三個品種由湖北省種子管理局提供；豐兩優香1號、荊兩優10號、深兩優5814、兩優6326、Y兩優1號、揚兩優6號6個品種由荊州市種子管理局從市場上抽取商品種子，并經生產企業確認。

所用引物及試劑均由北京鼎國生物有限公司提供。

1.2 DNA模板制備和引物選擇

DNA模板的制備：每個品種從田間抽取10株標準單株，用農業部推薦的簡易法提取DNA，用這10株單株的混合DNA作為模板進行鑒定。

引物選擇：選取在兩系雜交種純度檢測時使用頻率較高，且上述9個品種均可使用的RM17作為檢測引物。

1.3 PCR反應體系

PCR擴增反應總體積10 μL ：10×buffer 1 μL，10 mmol/L dNTP 0.2 μL，50 ng/μL primer 0.2 μL+0.2 μL，2U/μL Taq 酶 0.6 μL，25 ng/μL DNA 1 μL，ddH2O 6.8 μL。PCR擴增程序：94 ℃預變性4 min； 94 ℃變性15 s，55 ℃退火15 s，72 ℃延伸30 s，35個循環；72 ℃下延伸7 min。擴增產物在濃度為3%、含EB的瓊脂糖凝膠中進行電泳后，應用凝膠成像系統觀察記錄。

1.4 田間正季鑒定

田間鑒定于2011年4月15日播種，5月15日移栽。每品種田間種植1個小區，每小區種植500株，株行距為16.7 cm×26.7 cm，共10行，每行50株，并設親本對照。在抽穗前及齊穗后分兩次按GB/T 3543.5—1995進行田間純度鑒定，并觀察比較各品種間的植物學特征。

2 結果與分析

2.1 各品種純度的SSR鑒定結果

在同一條件下，利用SSR引物RM17對豐兩優香1號、荊兩優10號、深兩優5814、兩優6326、Y兩優1號、天兩優616、兩優17、苯兩優639和揚兩優6號9個兩系雜交稻品種進行室內純度的分子學檢測。結果表明，9個品種室內SSR引物鑒定譜帶特征一致，瓊脂糖電泳不能區別互相混雜的雜株類型（圖1）。由圖1可知，9個品種電泳后，都呈現出兩條清晰明亮的雙親互補帶，說明該引物能夠應用于這些品種的室內鑒定。但在相同的電泳時間內，用DL600 DNA Marker對比這些譜帶，發現這9個品種的譜帶在凝膠上的位置都在一條線上，分子量大小相當，用現行的室內鑒定方法無法區分出品種間的差異。

2.2 各品種純度的田間鑒定結果

9個品種田間種植鑒定植物學特征差異較大，易于區分品種間混雜的雜株類型（表1）。根據調查的特征特性的差異將受檢品種分成6類進行田間鑒定：①兩優17是早稻品種，可通過株高和生育期分辨；②深兩優5814和Y兩優1號可通過株型、劍葉葉型、葉位和穗部著粒密度辨別；③揚兩優6號和荊兩優10號的生育期最長，是其識別標志；④兩優6326的株型和整齊度較特殊；⑤其他3個品種中，苯兩優639可通過株高和生育期辨別，天兩優616系一季晚稻品種，生育期短，植株較矮，可與豐兩優香1號相區分。以上結果說明在同一栽培管理條件下，9個品種間都存在不同程度的差異，可在田間加以區分。

3 小結與討論

9個不同品種的田間植株植物學特征差異較大，但瓊脂糖凝膠電泳的譜帶完全一致。一方面說明該引物擴增的這些序列片段分子量差異小甚至相同；另一方面說明了瓊脂糖凝膠對SSR擴增片段的分辨率不高，不足以區分不同品種譜帶間的差異。

目前室內純度鑒定通常使用的引物可能都不是相應品種的特異引物，這極易造成在鑒定遺傳背景相近的同質化品種時出現誤判，使室內結果和田間結果之間產生誤差。如果混雜的雜株是兩個親緣相近但田間特征特性表現差異的品種，用本試驗采用的SSR標記來鑒定種子純度存在極大的風險，其結果也是不可靠的。因此，要使用單對引物來鑒定純度，必須建立DNA指紋數據庫，找到每個品種區別于其他品種的特異SSR片段，以及與之相應的特異SSR引物，才能將親緣相近的品種區分開。

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收稿日期：2012-04-11

基金項目：農業部公益性行業科研專項（201103007）

作者簡介：趙 虹（1965-），女，湖北天門人，農藝師，主要從事農作物種子質量檢驗及管理工作，（電話）13871189829（電子信箱）

jyjyk502@163.com；通訊作者，張 凱，（電話）0716-8400643（電子信箱）fongyun00@tom.com。