PI3K/mTOR抑制劑BEZ235抑制HepG2細胞增殖及與阿霉素的協同效應

張顯忠，郭愛軍，廉立慧，姜紅霞，史仁玖

(1.泰山醫學院生物科學學院，山東泰安 271016;2.泰安市中心醫院放射科，山東泰安 271000)

肝細胞癌是我國常見的惡性腫瘤之一，死亡率較高，發生發展受細胞內多條信號傳導通路的精密調控［1－2］。磷脂酰肌醇 3-激酶(phosphatidylinositol-3-kinases，PI3K)信號通路參與細胞的增殖、凋亡和分化等過程，在腫瘤的發生發展中起著重要的作用［3－4］。BEZ235是磷酸肌醇 3 激酶(PI3K)和其下游因子哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)的雙重靶向抑制劑，表現出良好的抑制多種實體瘤活性［5－7］。本研究以肝癌細胞

HepG2為實驗材料，檢測BEZ235的體外抗癌活性及與阿霉素(doxorubicin hydrochloride，DOX，adriamycin，ADM)協同抑癌作用，為肝細胞癌的臨床治療提供實驗基礎。

1 材料和方法

1.1 主要試劑 BEZ購自 Selleck Chemicals(Houston，TX，USA);RPMI 1640 培養基購自 Gibco(BRL，USA);胎牛血清購自 Lanzhou National Hy-Clone(Lan zhou，China);MTT購自 Genview(Houston，TX，USA);propidium iodine(PI)購自 Sigma;Annexin V-FITC購自南京凱基生物有限公司;ECL試劑盒購自 Thermo Scientific Pierce(Rockford，IL，USA)。Akt抗體、p-Akt抗體和 β-catenin抗體購自Cell Signaling;β-actin抗體購自Sigma;cyclinB1抗體和cyclinD1抗體購自Santa cruz;二抗均購自北京中杉金橋;DOX購自深圳萬樂藥業。

1.2 細胞株 人肝癌細胞株HepG2購自上海中科院細胞庫。HepG2細胞于37℃和5%CO2條件下用RPMI 1640培養基培養，含有10%胎牛血清(蘭州民海)、100 U·L－1青霉素和 100 μg·L－1硫酸鏈霉素。

1.3 MTT法測定細胞活力 胰酶消化HepG2細胞后接種于96孔板中，加入不同劑量的BEZ235繼續培養，對照組加入PBS;終止培養前4 h加20 μl(5 g·L－1)的MTT于各個孔中，然后吸去培養液，加入150 μl的DMSO后室溫振蕩10 min;490 nm波長下測定各孔的A值，以同樣的方法測6個平行孔，對結果進行統計分析。

1.4 流式細胞術檢測細胞周期與凋亡 細胞用BEZ235處理后，胰酶消化并制備細胞懸液;加入75%的冷無水乙醇4℃固定18 h后用PBS洗2次，加入終濃度為50 mg·L－1的 RNase A，37℃ 30 min，加入終濃度為 50 mg·L－1的 PI，4℃閉光染色 20 min后上機檢測。用Cell Quest軟件分析各組細胞的周期分布，分析G0/G1期、S期和G2/M期細胞所占比例。同時按照試劑盒說明進行 AnnexinⅤ-FITC/PI法測定細胞凋亡，根據AnnexinⅤ和PI的熒光強度計算凋亡百分率。實驗重復3次。

1.5 免疫印跡分析 預冷PBS洗細胞2次后加細胞裂解液(10 mmol·L－1Tris-HCl pH 8.0，1 mmol·L－1EDTA，150 mmol·L－1NaCl，1%NP-40，1 mmol· L－1PMSF，0.5% SDS，protease inhibitor cock-tails)，冰上放置20 min，4℃ 13 000×g離心20 min，收集上清定量分析。取40 μg總蛋白進行 SDSPAGE實驗，電轉移至PVDF膜上，5%脫脂奶粉封閉過夜，分別加入抗 Akt、p-Akt、β-actin、cyclinB1、cyclinD1、β-catenin、p-ERK 和 p-P38一抗;室溫孵育3 h后加入對應的二抗室溫孵育1 h，PBST洗膜，ECL顯色試劑盒于暗室曝光顯影。實驗重復3次。

1.6 統計學分析 SPSS軟件t檢驗分析實驗結果，實驗數據以±s表示。

2 結果

2.1 BEZ235抑制HepG2細胞內Akt的磷酸化

由于BEZ235是PI3K/Akt通路的抑制劑，因此本實驗首先采用免疫印跡法檢測了BEZ235對HepG2細胞中PI3K下游底物Akt磷酸化水平的影響。如Fig 1所示，BEZ235降低了HepG2細胞中Akt的磷酸化水平，且抑制作用呈劑量依賴性。

2.2 BEZ235抑制HepG2肝癌細胞的增殖 用BEZ235處理HepG2細胞72 h，MTT法每隔24 h檢測細胞活力，結果見Fig 2，BEZ235具有抑制肝癌細胞增殖的活性，且呈時間和劑量依賴性。

流式細胞術檢測BEZ235對細胞周期的影響，如圖所示(Fig 3)，HepG2細胞經BEZ235處理后，誘導細胞阻滯于G1期。但Annexin V-FITC/PI雙標法檢測BEZ235對HepG2細胞凋亡的影響。HepG2細胞經BEZ235作用24 h后，發現HepG2細胞的凋亡無明顯變化(Fig 4)。

Fig 1 Akt phosphorylation in HepG2 cells inhibited by BEZ235

Fig 2 Effects of BEZ235 on HepG2 cell viability detected by MTT

Fig 3 Effects of BEZ235 on HepG2 cell cycle detected by flow cytometry

2.3 BEZ235調節細胞內 cyclinB1和 cyclinD1蛋白表達水平 為了闡明BEZ235阻滯細胞周期的可能機制，采用免疫印跡法分析了細胞內cyclinB1和cyclinD1的蛋白水平，發現BEZ235對細胞周期的調控與cyclinD1相關，而對cyclinB1的表達無影響(Fig 5)。

Fig 4 Effects of BEZ235 on cell apoptosis detected by Annexin V/PI double staining

Fig 5 Effects of BEZ235 on expression level of cyclin B，and cyclinD，in HepG2 cells detected by western blot

2.4 BEZ235對 DOX抑癌活性的協同作用BEZ235與 DOX聯合應用后，從抑制曲線上看，BEZ235明顯提高了DOX對HepG2細胞的抑制作用，根據CDI計算方法［8］，除了低劑量組外(BEZ235=0.5 μmol·L－1DOX=0.5 mg·L－1)，其他兩組聯合用藥的CDI均小于1，提示BEZ235聯合應用DOX具有協同效應。

Fig 6 Synergistic effects of BEZ235 combined with DOX on HepG2 cells

2.5 BEZ235與DOX的聯合應用抑制細胞內βcatenin表達 為了進一步探討BEZ235與DOX協同抑癌效應的分子機制，采用免疫印跡實驗檢測了HepG2細胞內β-catenin和MAPK通路因子p-ERK、p-p38的表達水平變化，發現BEZ235與DOX的聯合應用明顯抑制細胞內β-catenin的表達，ERK和p38的磷酸化水平未見明顯變化。

Fig 7 Inhibition of β-catenin expression in HepG2 cells by BEZ235 combined with Dox

3 討論

研究發現，PI3K/Akt/mTOR信號通路不僅參與調節細胞的增殖、凋亡和代謝等生命過程，該途徑的過度活化還與腫瘤的耐藥性有著密切的聯系，可降低腫瘤細胞對化療藥物的敏感性［9－11］。因此，研究PI3K/Akt/mTOR信號通路的特異性抑制劑對癌癥的臨床治療具有重要的意義。以PI3K的p110催化亞基為靶點的LY294002和wortmannin與化療藥物聯合使用能夠有效地增加化療藥物的作用并降低毒性［12］，表明PI3K抑制劑與傳統化療藥物的聯用為腫瘤患者的耐藥現象提供了更好的選擇。

本研究首先檢測PI3K/Akt抑制劑BEZ235對HepG2細胞中Akt磷酸化水平的影響，發現BEZ235具有抑制S473p-Akt的活性，同時抑制了肝癌細胞的增殖，且抑制作用具有時間和劑量依賴性。為了進一步闡明BEZ235抑制肝癌細胞增殖的分子機制，流式細胞術分析了BEZ235對細胞周期的影響，發現HepG2細胞經BEZ235處理后，細胞阻滯于G1期。免疫印跡實驗表明BEZ235誘導肝癌細胞周期的阻滯與抑制cyclinD1的表達密切相關。磷脂酰絲氨酸外翻分析法結果表明檢測BEZ235對HepG2細胞無明顯凋亡誘導活性，意味著BEZ235的抗腫瘤活性主要表現在其抑制腫瘤細胞的增殖。

DOX是臨床上常用的蒽醌類化療藥物，本研究首次將BEZ235與DOX聯合應用處理肝癌細胞，發現BEZ235能夠促進DOX的抑癌活性，其機制涉及抑制β-catenin表達。β-catenin是由781個氨基酸組成的單鏈蛋白質，是Wnt通路的關鍵因子，可通過Wnt/Frizzled受體通路促進原癌基因的激活，并誘導細胞癌變和腫瘤發生。本研究發現BEZ235與DOX的聯合應用抑制β-catenin的表達水平，提示BEZ235與DOX的協同作用可能與調控HepG2細胞內的β-catenin通路相關。另外，β-catenin的高表達與腫瘤的轉移和耐藥性也相關。因而提示，BEZ235與DOX聯合，除產生協同相應外，還可能防治腫瘤轉移和耐藥發生。

總之，BEZ235能夠抑制HepG2肝癌細胞中Akt的磷酸化水平，并抑制細胞的增殖，其機制與調節細胞周期相關蛋白cyclinD1的表達水平有關;BEZ235和DOX的聯用對人肝癌細胞株HepG2細胞的生長抑制具有協同作用，其機制與抑制細胞中β-catenin的表達相關。

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