TGF-β1-Samd3信號轉導在星形膠質細胞增殖中的作用

余傳勇，桂 韋，黃 琳，王 玉

(安徽醫科大學第一附屬醫院神經內科，安徽合肥 230022)

在腦損傷、癲癇等多種中樞神經系統(CNS)疾病的病理生理過程中，星形膠質細胞激活并過度增生形成膠質瘢痕［1］。激活的星形膠質細胞一方面可以分泌和合成大量的細胞外基質(ECM)抑制神經軸突的生長［2］，另一方面膠質瘢痕形成機械性屏障阻礙軸索再生長，從而影響神經功能的修復［3］。此外，星形膠質細胞的增殖及膠質疤痕形成還是某些腦病，如癲癇的腦功能紊亂的病理基礎［4－5］，因此對CNS膠質疤痕的深入研究具有重要意義。研究發現在腦血管疾病、癲癇等腦損傷疾病中，轉化生長因子β1(TGF-β1)含量由正常生理情況下的微量表達轉而明顯增加［6］。本文作者 Wang 等［7］發現TGF-β1的下游轉導因子Samd3基因敲除小鼠腦損傷后膠質疤痕形成明顯被抑制，然而，目前尚無證據表明Samd3對膠質疤痕形成的影響系經由TGF-β1-Samd3信號轉導來完成的，因為Smad3同樣轉導來自TGF-β家族中其它細胞因子的信號。本文通過SiRNA干擾技術，探討TGF-β1-Smad3信號轉導通路在星形膠質細胞增殖中的作用，以期從星形膠質細胞分裂增殖的角度研究CNS膠質疤痕形成的細胞內信號轉導機制，為腦損傷后中樞神經系統膠質疤痕形成的干預治療提供實驗基礎。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 膠質纖維酸性蛋白(GFAP)抗體購自Doka公司，胰酶和胎牛血清均購自Hyclone公司，多聚賴氨酸和Lipofectamine2000均為Sigma公司產品，DMEM培養基購自Gibco公司，5-溴脫氧尿嘧啶核苷(BrdU)抗體購自Abcam公司。

1.2 方法

1.2.1 小鼠星形膠質細胞的培養與鑒定［8］取出生后3 d內的ICR小鼠(安徽省實驗動物中心)，無菌條件下斷頭取出大腦皮質部分，投入HBSS中，仔細剔除中腦、嗅球、海馬、腦膜及毛細血管等結構，進行星形膠質細胞的原代培養。在含體積分數為10%胎牛血清DMEM培養液中，單層細胞培養，37℃5%CO2孵箱中培養1周后傳代。使用兔抗GFAP對星形膠質細胞進行染色，予以鑒定，GFAP陽性細胞率超過95%。

1.2.2 實驗分組及藥物處理 將純化培養的第2代星形膠質細胞用0.25%的胰酶消化成單細胞懸液，以1×104/孔接種于96孔培養板中，培養48 h，觀察細胞完全貼壁。將實驗分4組，每組15個孔，分別加入濃度為1、5、10 μg·L－1的 TGF-β1，并設對照組，同時加入 BrdU抗原(終濃度20 μmol·L－1)培養48 h，觀察TGF-β1對星形膠質細胞增殖的影響;經過同樣的培養過程，將實驗分4組，Smad3-SiRNA-1，Smad3-SiRNA-2，Smad3-SiRNA-3 及對照組，每組15孔，同時加入 BrdU抗原(終濃度20 μmol·L－1)，觀察Smad3基因沉默對星形膠質細胞增殖的影響;經過同樣的培養過程，將實驗分5組，每組12個孔，分別加入濃度為10 μg·L－1的TGF-β1以及 Smad3-SiRNA-1，Smad3-SiRNA-2及 Smad3-SiRNA-3，并設 10 μg·L－1的 TGF-β1 對照以及空白對照，同時加入 BrdU抗原(終濃度20 μmol·L－1)培養48 h，觀察Smad3基因沉默對TGF-β1促進星形膠質細胞增殖影響的干擾作用。

1.2.3 免疫細胞熒光直接觀察細胞增殖情況 取來經TGF-β1及BrdU處理48 h后的星形膠質細胞，棄去培養液，PBS洗滌5 min，4%多聚甲醛固定30 min，2 mol·L－1鹽酸暴露 BrdU 標記部位 30 min，0.3%TritonX-100通透45 min，5%羊血清封閉1 h，分別加入兔抗GFAP+大鼠抗BrdU抗體，常溫孵育1 h后放入4℃冰箱孵育過夜，PBS洗滌3次，充分洗去一抗，加入熒光標記二抗:羊抗大鼠FITC+羊抗兔CY3，室溫避光孵育3 h，PBS洗滌3次后，DAPI染核20 min，PBS洗滌3次，在熒光顯微鏡(Olympus IX71)下分別觀察GFAP、BrdU和DAPI的標記情況，在熒光顯微鏡下，對已行GFAP、BrdU和DAPI三染的96孔板，每孔取互不重疊的4個視野，進行拍照，然后計算BrdU陽性細胞數占星形膠質細胞總數的百分比進行計數統計。增殖率計算為BrdU+GFAP+DAPI三染細胞數與GFAP+DAPI雙染細胞數比值，數據以±s%表示。

1.2.4 SiRNA 沉默技術

1.2.4.1 SiRNA合成 我們根據小鼠Smad3基因編號序列特征，依照SiRNA的設計原則，由廣州市銳博生物科技有限公司合成3對Smad3-SiRNA:Smad3-SiRNA-1正義鏈:5'CAGUUCUACCUCCAGUGUU dTdT 3'，反義鏈:3'dTdT GUCAAGAUGGAGGUCACAA 5';Smad3-SiRNA2正義鏈:5'CCAUGACAGUAGAUGGCUU dTdT 3'，反義鏈:3'dTdTGGUACUGUCAUCUACCGAA 5';Smad3-SiRNA-3正義鏈:5'CGCAGAACGUGAACACCAA dTdT 3'，反義鏈:3'dTdTGCGUCUUGCACUUGUGGUU 5'，對相應基因進行沉默。

1.2.4.2 Smad3-SiRNA轉染入細胞 星形膠質細胞體外培養1周后，傳代至6孔板及96孔板中，培養3天，細胞融合率約達到70% ～75%時進行轉染，用Lipofectamine2000作載體轉染Smad3-SiRNA，轉染過程按轉染試劑說明書進行。轉染6 h后更換新鮮DMEM培養基，培養2 d后，對細胞進行固定染色并在顯微鏡下觀察，轉染效率用RT-PCR進行檢測。

1.2.4.3 應用 RT-PCR技術驗證基因沉默 取2代星形膠質細胞，傳入6孔板，分5組，Smad3-SiRNA-1，Smad3-SiRNA-2，Smad3-SiRNA-3，TGF-β1 及對照組。用TRIzol液裂解細胞，提取mRNA，按Fermentas逆轉錄試劑盒操作步驟，逆轉錄mRNA為cDNA，再進行PCR擴增，Smad3引物序列:上游:5'-ACAAGGTCCTCACCCAGATG3'，下游:5'-TGGCGATACACCACCTGTTA 3';β-actin引物序列:上游:5'-CAGTAACAGTCCGCCTAGAA-3'，下 游:5'-GATTACTGCTCTGGCTCCTA-3';PCR體系:TaqLA酶0.5 μl，10 × buffer 2.5 μl，dNTP 4 μl，上下游引物各 1 μl，cDNA 1 μl，無酶水 15 μl，共 25 μl，反應條件:94℃ 5 min，94℃ 1 min，60℃ 1 min，72℃ 1 min 45 s，72℃ 7 min，共35個循環，通過凝膠成像系統進行拍照，記錄結果。

2 結果

2.1 TGFβ1促進星形膠質細胞的增殖 不同濃度的 TGF-β1(1、5、10 μg·L－1)對星形膠質細胞增殖均有促進作用。BrdU+DAPI+GFAP共染為增殖細胞數，DAPI+GFAP共染為細胞總數，增殖率=增殖細胞數/細胞總數，計算增殖率。1 μg·L－1TGF-β1組增殖率為(48.19 ± 3.49)%，5 μg·L－1TGF-β1組增殖率(50.92 ±4.71)%，10 μg·L－1TGF-β1 組增殖率為(62.39±4.14)%，與對照組(34.73±1.74)%相比，明顯增高，并呈現一定的劑量依賴性，即 10 μg·L－1與 1 μg·L－1比較 P ＜ 0.05，而 5 μg·L－1與 1 μg·L－1以及 10 μg·L－1相比，差異均無統計學意義(Tab 1)。

Tab 1 Effect of TGF-β1 on astrocyte proliferation(±s，n=6)

Tab 1 Effect of TGF-β1 on astrocyte proliferation(±s，n=6)

*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs control;#P ＜0.05 vs 1 μg·L－1group

Group Percentage of BrdU incorporation/%1 μg·L －1 48.19 ±3.49*5 μg·L －1 50.92 ±4.71*10 μg·L －1 62.39 ±4.14＊＊#Control 34.73 ±1.74

2.2 Smad3-SiRNA成功沉默Samd3基因的表達PCR產物瓊脂糖凝膠電泳結果(Fig1 A)顯示，TGF-β1為陽性組，可見清晰條帶;沉默組 Smad3-SiRNA-1以及Smad3-SiRNA-3的mRNA水平明顯低于對照組，而Smad3-SiRNA-2與對照組相比mRNA水平無差別(Fig1 B)，表明Smad3-SiRNA-2沒有沉默相關基因，而 Smad3-SiRNA-1和Smad3-SiRNA-3成功轉染入細胞，并成功沉默相關基因。

2.3 Smad3-SiRNA抑制星形膠質細胞的增殖Smad3-SiRNA沉默Smad3基因后明顯降低了星形膠質細胞增殖率，星形膠質細胞數量也明顯減少(Fig 2)。

Fig 1 Levels of Smad3 mRNA in astrocytes exposed to various types of Smad3-SiRNA or TGF-β1

Smad3-SiRNA-1組增殖率(17.33±1.83)%、Smad3-SiRNA-3組增殖率(15.83±2.10)%與對照組增殖率(35.50±3.17)%相比，明顯減低，差異有統計學意義，而Smad3-SiRNA-2組增殖率(32.00±1.73)%與對照組相比，無統計學意義(Tab 2)。

Tab 2 Effect of Smad3-SiRNA on astrocyte proliferation(±s，n=6)

Tab 2 Effect of Smad3-SiRNA on astrocyte proliferation(±s，n=6)

＊＊P＜0.01 vs control

Group Percentage of BrdU incorporation/%Smad3-SiRNA-1 17.33 ±1.83＊＊Smad3-SiRNA-2 32.00 ±1.73 Smad3-SiRNA-3 15.83 ±2.10＊＊Control 35.50 ±3.17

2.4 Smad3-SiRNA阻斷TGF-β1對星形膠質細胞增殖的促進作用 Smad3基因被成功沉默后，TGF-β1+Smad3-SiRNA-1組增殖率(24.55±2.33)%、TGF-β1+Smad3-SiRNA-3 組 增 殖 率 (27.83 ±2.39)%與對照組增殖率(40.40±3.16)% 及10 μg·L－1TGF-β1組增殖率(58.64±5.32)%相比明顯減低，結果差異有統計學意義;而TGF-β1+Smad3-SiRNA-2組增殖率(46.70±3.83)%與10 ng·ml－1TGF-β1組相比，結果差異無統計學意義，但與對照組相比增殖率明顯增高，結果有統計學差異(Tab 3)。

Arrows indicate the cells co-labeled with GFAP，BrdU and DAPI.(Bars=100 μm)

Tab 3 Effect of Smad3-SiRNA+TGF-β1 on astrocyte proliferation(±s，n=6)

Tab 3 Effect of Smad3-SiRNA+TGF-β1 on astrocyte proliferation(±s，n=6)

＊＊P ＜0.01 vs TGF-β1;#P ＜0.05 vs control;△P ＜0.05 vs control

Group Percentage of BrdU incorporation/%Smad3-SiRNA-1+TGF-β1 24.55 ±2.33＊＊#Smad3-SiRNA-2+TGF-β1 46.70 ±3.83△Smad3-SiRNA-3+TGF-β1 27.83 ±2.39＊＊#TGF-β1 58.64 ±5.32 Control 36.40 ±3.16

3 討論

TGF-β參與細胞的生長、分化及組織炎癥、損傷修復等多種生物學作用，具有多重生物學功能［9］，它是一種多效的多肽細胞因子，包括TGF-β1、TGF-β2和TGF-β3，其中TGF-β1是細胞和組織中含量最豐富的，在大多數腦損傷的疾病中都會檢測到TGF-β1 含量的明顯增高［10］。TGF-β1 激活的信號通路主要有以下幾種，Smads通路、MAPK(mitogen-activated protein kinase)通路、NF-κB 通路、P B kinase/AKT 通路等［11］。近年來研究表明 TGF-β1-Smad3信號轉導途徑是其重要的轉導路徑，此信號路徑主要成員包括TGF-β1、相應受體、胞質蛋白 Smads、早期應答轉錄因子等［12］。此通路在肺纖維化、肝纖維化以及皮膚瘢痕形成中的研究已較明確，可促進成纖維細胞的過度增生、分化，促進細胞外基質的過度聚集而引起病變［11］，而其在中樞神經系統膠質細胞改變中的作用國內外尚未見報道。

本實驗通過給予不同濃度的 TGF-β1(1、5、10 μg·L－1)加入體外培養的星形膠質細胞中，發現TGF-β1能明顯促進星形膠質細胞增殖(P＜0.05)，并出現一定程度的濃度依賴效應。這一結果與以往的報道一致［13］，但其下游機制目前尚不明確。為了進一步研究TGF-β1是如何促進星形膠質細胞增殖，通過何種機制介導，我們應用目前在基因功能研究中重要的研究手段RNA干擾技術，RNA干擾技術有直接轉染雙鏈SiRNA和載體表達發夾RNA兩種［14］，我們采用前者。成功沉默Smad3基因，干擾TGF-β1-Smad3信號轉導通路后，星形膠質細胞增殖明顯受到抑制。同時，我們還發現，成功沉默Smad3基因能阻斷TGF-β1對星形膠質細胞增殖的促進作用，這些結果說明TGF-β1促進星形膠質細胞的增殖系通過Smad3完成信號轉導的。

綜上所述，本文通過沉默Smad3基因，以及加大TGF-β1的劑量，正反兩方面證實TGF-β1-Smad3信號轉導通路在星形膠質細胞增殖中起重要作用。由于膠質疤痕中的主體構架系由星形膠質細胞組成，由此我們可以推斷該通路在膠質疤痕形成中可能起重要作用。中樞神經系統損傷后，星形膠質細胞激活，一方面由損傷周圍向損傷中心部位移行增殖，另一方面星形膠質細胞經由分裂而增加細胞數，在損傷中心部位形成膠質疤痕［15］，構成機械屏障從而機械性的阻礙神經元再生［3］。所以在CNS損傷后，我們可以通過對該通路進行干擾，從而阻止膠質疤痕的產生，抑制了機械屏障的形成，從而促進神經元的再生，為神經再生的基因治療提供了理論依據。

在我們的后續工作中，我們將在體內探討TGF-β1-Smad3信號轉導通路對膠質疤痕形成的調節機制，以及進一步研究TGF-β1-Smad3信號轉導通路的下游機制，為腦損傷后基因治療減少膠質疤痕形成、促進神經再生提供理論和實踐依據。

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