黃芩苷對FM1肺炎小鼠肺損傷的作用機制研究

萬巧鳳，顧立剛，殷勝駿，吳 珺，邱澤計

(1.北京中醫藥大學中醫藥抗病毒教育部重點實驗室，北京 100029;2.寧夏醫科大學，寧夏銀川 750004)

甲型流感病毒是具有高度傳染性呼吸道病毒，可引起人和動物高發病率和病死率。在抗流感病毒方面，中藥通過阻止病毒致細胞病變、調節免疫功能、改善肺循環、抗炎等綜合功效而發揮抗病毒作用。黃芩苷(Baicalin，BAI)是從黃芩(Scutellaria baicalensis)中提取的多酚羥基黃酮類單體，具有抑菌［1］、清除氧自由基［2］、抗腫瘤［3］、抗凋亡［4］等多種作用。本課題組前期做了黃芩苷體外抗流感病毒實驗，表明黃芩苷對流感病毒誘導的細胞氧化應激、凋亡有抑制作用。黃芩苷(0.96～1.5 g·kg-1)對流感病毒感染導致的小鼠死亡有很好的保護作用［5］。關于黃芩苷體內抗流感病毒的作用機制國內外鮮有報道。本實驗制備了小鼠甲型流感病毒性肺炎模型，通過觀察肺組織病理改變、檢測肺組織轉錄因子AP-1在基因和蛋白兩個水平的表達及檢測肺勻漿炎性細胞因子分泌水平，初步探討黃芩苷抗流感病毒的作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物與流感病毒 ICR小鼠，清潔級，體質量13～15 g，小鼠及飼料均由北京維通利華實驗中心提供，合格證號:0194690。流感病毒亞甲型鼠肺適應株FM1由中國中醫藥研究院中醫所提供，于9日齡雞胚尿囊腔連續傳代2次后測血凝滴度為2-7。測定其對小鼠的半數致死量(LD50)為10-3.17，確定造模濃度為2倍LD50。

1.1.2 實驗藥品與試劑 黃芩苷，純度92%，由遼寧中醫藥大學初正云教授惠贈;利巴韋林(ribavirin，RBV)顆粒，四川百利藥業有限責任公司，批號100725。TRIzol試劑盒(Invitrogen公司)，兩步法反轉錄試劑盒(TaKaRa)，Agarose(Promega)，DEPC(Sigma)，DNA Marker(北京全式金生物技術有限公司)，引物由上海生工生物工程公司合成，c-jun一抗(bioworld，批號 360858)，P-c-jun/AP-1 一抗(bioworld，批號360756)。HRP標記山羊抗兔IgG二抗(北京中杉金橋生物技術有限公司，批號91664)，βactin(Invitrogen公司)，Western blot其它試劑及H-E染色材料由本室配備。ELISA試劑盒(尚柏生物醫學技術北京有限公司):TNF-α(RB，貨號2R602)，IL-1β(RB，貨號2R432)。

1.2 方法

1.2.1 分組及肺炎模型制備 訂購ICR小鼠96只，♀♂各半，隨機分為正常對照組，模型組，RBV組(100 mg·kg-1)，BAI組(1500、750、375 mg·kg-1)，每組16只，將各組小鼠用乙醚輕度麻醉，正常對照組以0.05 ml生理鹽水滴鼻，其余各組以0.05 ml的2倍LD50FM1稀釋液滴鼻。

1.2.2 藥物治療及實驗樣本采集 于感染后24 h開始灌胃給藥，正常對照組、模型組灌同量的蒸餾水，其余各組按相應劑量給藥，每天1次，共給藥4 d，d 6禁食禁水8 h，摘眼球放血致死，無菌摘取全肺。每組隨機取4只全肺固定于10%的甲醛溶液。其余全肺分為兩半，其中一半制作肺勻漿，另一半存于液氮備用。

1.2.3 肺組織病理切片制作 將固定好的標本行石蠟包埋，切片5 μm，經H-E染色、中性樹膠封固后顯微鏡觀察照相。

1.2.4 RT-PCR檢測肺組織c-jun、c-fos mRNA表達每組隨機取5只小鼠肺組織進行RT-PCR定量實驗。TRIzol提取各組肺組織總RNA，紫外分光光度計定量。取3 μg為模板反轉錄合成cDNA，以2 μl cDNA為模板進行PCR擴增。引物序列為:β-actin(385 bp):上游5'-GGT GTG ATG GTG GGA ATG-3'，下游5'-GCA TAG CCC TCG TAG ATG G-3';c-jun(327bp):上游 5'-CCT GCC TTT GTA AGT TAT TCC-3'，下游5'-GCA TAG CCC TCG TAG ATG G-3';c-fos(263 bp):上游5'-GAG AAT CCG AAG GGA ACG-3'，下游 5'-GGC AGA CCT CCA GTC AAA-3'，PCR反應總體積為20 μl，擴增條件:預變性95℃ 5 min，變性95℃ 30 s、退火55℃ 30 s、延伸72℃ 30 s，共30個循環后72℃延伸3 min，4℃終止反應。RTPCR產物行1.2%瓊脂糖凝膠電泳，溴化乙錠顯色后用凝膠成像分析系統測定各目的條帶與β-actin的IOD值，其比值為目的基因的相對表達量。

1.2.5 Western blot檢測肺組織c-jun、p-c-jun蛋白表達 每組隨機取5只小鼠肺組織進行Western blot實驗。將肺組織樣本于液氮中研磨致粉末，加入裂解液，Bradford法蛋白定量。取總蛋白40 μg，以1×樣品緩沖液配平上樣體積，沸水浴5 min后上樣，SDS-PAGE電泳(濃縮膠80V，分離膠100V)，半干電轉膜儀轉膜(30 mA，90 min);封閉后分別加入c-jun、p-c-jun一抗，4℃過夜;TBS-T漂洗液洗膜10 min，共3次;加入 HRP標記的二抗，37℃振蕩60 min;加入ECL發光液，X線膠片曝光，經顯影、定影、掃描后觀察結果。應用Image-Pro Plus軟件對掃描圖像的目的條帶進行灰度分析，各目的條帶與βactin的灰度比值為目的蛋白的相對表達量。

1.2.6 肺組織勻漿TNF-α、IL-1β含量測定 將各組12只肺組織，按參考文獻［6］制備肺勻漿。程序按照試劑盒說明書進行。

1.3 統計學分析 采用SPSS13.0軟件分析。實驗數據以±s表示，組間比較用t檢驗。

2 結果

2.1 BAI對肺組織病理形態的影響 H-E染色切片光鏡下觀察結果:正常對照組小鼠肺泡、肺泡囊、肺泡管、肺泡隔形態完整，肺泡壁厚度正常，支氣管上皮完整，管腔內無分泌物，外周未見炎性細胞浸潤。模型組呈現重度間質性肺炎病變，肺泡、肺泡囊、肺泡管、肺泡隔、細支氣管等正常的組織結構消失，形成實變區，組織間見大量紅細胞，血管內充血。RBV組和 BAI 750、375 mg·kg-1組肺泡、肺泡囊、肺泡管等肺組織形態結構較為完整，肺泡隔較正常對照組有所增厚，偶見少量的淋巴細胞的浸潤及少量血管內充血;BAI 1 500 mg·kg-1組肺組織形態結構病變有所改善，但效果不明顯，見Fig 1。

2.2 BAI對肺組織c-jun、c-fos mRNA表達的影響與正常對照組相比，模型組c-jun、c-fos mRNA表達明顯升高(P＜0.01);與模型組比較，RBV和BAI 375 mg·kg-1組c-jun、c-fos mRNA表達降低(P＜0.01)，BAI 750 mg·kg-1組 c-jun 、c-fos mRNA 表達降低(P ＜0.05)，BAI 1 500 mg·kg-1組 c-jun 、c-fos mRNA表達降低(P＞0.05，P＜0.05)，見Fig 2。

2.3 BAI對肺組織c-jun、p-c-jun蛋白表達的影響與正常對照組相比，模型組c-jun、p-c-jun蛋白表達明顯升高(P＜0.01)。與模型組比較，RBV與BAI 750、375 mg·kg-1組 c-jun、p-c-jun 蛋白表達降低(P ＜0.01)，BAI 1 500 mg·kg-1組 p-c-jun蛋白表達降低(P＜0.05)、c-jun蛋白表達有下降趨勢(P＞0.05)，見 Fig 3。

2.4 BAI對肺組織勻漿炎性細胞因子TNF-α、IL-1β的影響 與正常對照組相比，模型組TNF-α、IL-1β分泌明顯升高(P＜0.01)。與模型組比較，RBV組及 BAI 750、375 mg·kg-1組 TNF-α 分泌降低(P＜0.01)，BAI 1 500 mg·kg-1組 TNF-α 分泌降低(P＜0.05);RBV 組及 BAI 750、375 mg·kg-1組 IL-1β分泌降低(P ＜0.01)，BAI 1 500 mg·kg-1組 IL-1β分泌有降低趨勢(P＞0.05)，見Tab 1。

Tab 1 Effect of BAI on the secretions of inflammatory cytokines(±s，n=12)

Tab 1 Effect of BAI on the secretions of inflammatory cytokines(±s，n=12)

△△P ＜0.01 vs normal group;*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs model group

Group Dose/mg·kg-1 TNF-α/ng·L-1 IL-1β/ng·L -1 Normal 143.32±23.72 143.33±24.53 Model 218.30±31.05△△185.98±30.71△△RBV 100 152.07±25.33* 148.56±21.33＊＊BAI 1500 186.19±17.67* 178.32±24.31 750 159.02±25.48＊＊156.69±21.38＊＊375 153.46±25.09＊＊153.61±21.90＊＊

Fig 1 Effect of BAI on the pathological structure of lung tissue infected with FM1(H-E×100)

Fig 2 Effect of BAI on mRNA expressions of c-jun and c-fos in FM1 infected mice lung(±s，n=5)

3 討論

研究表明，甲型流感病毒感染后的上皮細胞和巨噬細胞可誘導 NF-κB和AP-1活化，磷酸化 NF-κB和AP-1入核后調控下游多種生物學活性的致炎細胞因子 TNF-α、IL-1、IL-6、IL-8 的表達［7-8］。如果病毒不能被及時清除，就會造成大量炎細胞的浸潤而損傷正常細胞的結構和功能，從而引起病毒性肺炎［9］。

AP-1是細胞內重要的轉錄因子，屬于亮氨酸拉鏈蛋白家族，由 jun(c-jun、junB 和 junD)、fos(c-fos、fosB、fral和fra2)組成的同型或異型二聚體，jun蛋白可以形成同源二聚體，而fos蛋白只能與jun蛋白聚合成異源二聚體［10］。在正常狀態下，AP-1以同源二聚體為主且濃度和活性很低;當機體受到病原體刺激時，AP-1蛋白短時間內迅速升高，而且轉變為以c-fos與c-jun異二聚體為主的存在形式，該二聚體穩定且具有與DNA結合的強大的親和力，能與某些基因啟動子TAP反應元件(TRE)或cAMP反應原件(CRE)結合而調控基因表達［11］，從而調節細胞的增值、分化和轉化，參與體內免疫系統的調控、細胞凋亡的發生以及炎性細胞因子的表達等［12-13］。由于c-jun亞基是構成AP-1蛋白的結構成分之一，所以通過測定c-jun亞基的表達量便可確定AP-1蛋白的表達量，而通過測定p-c-jun含量便可確定細胞核中有活性AP-1的含量。

Fig 3 Effect of BAI on protein expressions of c-jun and p-c-jun in FM1 infected mice lung(±s，n=5)

本實驗結果顯示，模型組的肺組織病變很嚴重，c-jun、c-fos mRNA，c-jun、p-c-jun 蛋白，致炎細胞因子 TNF-α、IL-1β 分泌水平明顯升高;經 BAI 750、375 mg·kg-1治療后，肺組織病變明顯改善，肺組織細胞c-jun、c-fos mRNA以及c-jun、p-c-jun蛋白表達明顯下降，肺勻漿的致炎細胞因子TNF-α、IL-1β分泌水平降低。這表明BAI能通過抑制AP-1信號通路的激活來降低炎性細胞因子分泌，從而減輕病理損傷，對流感引起的肺炎有良好的治療作用。

本實驗1 500 mg·kg-1劑量的BAI作用效果不明顯，可能與高劑量BAI的類抗生素作用有關。口服BAI后，其在腸道菌作用下先被水解為黃芩素，后者通過腸黏膜被吸收，再被轉化成BAI。因此，BAI的口服吸收受到腸道厭氧菌群水解作用的制約［14-15］。BAI 1 500 mg·kg-1可能因濃度高引起了菌群系統的失調，從而影響了BAI的吸收效率。BAI抗甲型流感病毒的最小有效劑量將需要進一步研究確定，待后續報道。

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