黃芩提取物中黃酮類成分血漿蛋白結合率的測定

馮志強，韓 堅，謝智勇，廖瓊峰，張 蕾

(1.廣州中醫藥大學中藥學院，廣東廣州 510006;2.中山大學藥學院，廣東 廣州 510080)

黃芩(Radix Scutellariae)為唇形科植物黃芩(Scutellaria baicalensis Georgi)的干燥根，主要活性成分為黃酮類化合物［1］。臨床上藥理作用廣泛，在許多方劑中均有配伍使用，如《金匱要略》收載方劑248方，其中含黃芩有20余方［2］。血漿蛋白結合率是進行藥動學研究的重要參數［3］，而關于黃芩黃酮類成分，目前僅有黃芩苷單體血漿蛋白結合率的報道文獻［4-5］，對于總黃酮部位中多種黃酮類成分血漿蛋白結合率的研究尚未見報道。本文以黃芩苷(namely baicalin，BL)、漢黃芩苷(wogonoside，WL)、漢黃芩素(wogonin，W)、千層紙素A(oroxylin A，OA)作為檢測指標，采用平衡透析法研究其在大鼠血漿中的藥物蛋白結合率，為進一步研究黃芩及其復方的藥動學提供基礎參數。

1 儀器與材料

1.1 儀器 AnkeTDL-40B離心機(上海科學安瓶科學儀器制造廠);Precisa XS225A十萬分之一分析天平;天美T2000P高效液相色譜儀(UV detector，上海天美科學儀器有限公司);透析袋(14 000 D，廣州文睿科學儀器有限公司)。

1.2 試藥 黃芩總黃酮(水提酸沉;各指標成分含量:黃芩苷50.05%，漢黃芩苷1.06%，漢黃芩素6.39%，千層紙素A 0.83%);黃芩苷、漢黃芩素(中國藥品生物制品檢定所，批號:110715-200212、1514-200202);漢黃芩苷(西安融升生物科技有限公司，批號:091126，含量＞98%);千層紙素 A、高麗槐素(自制，含量＞98%);色譜甲醇、乙腈(Merk公司);其余試劑為分析純。

1.3 實驗動物 SD大鼠，180～220 g，♀♂各半，廣州中醫藥大學實驗動物中心。

2 方法與結果

2.1 色譜條件 Phenomenex Synergi C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm);流動相:乙腈(A)-0.1% 甲酸水(B)，梯度洗脫:0～5 min(A:32% ～35%)，5～15 min(A:35% ～50%)，15 ～25 min，(A:50% ～50%);流速 1.0 ml·min-1;檢測波長:275 nm;進樣量:20 μl。

2.2 樣品處理

2.2.1 透析內液 取空白血漿(或透析內液)200 μl，加入混合系列對照品溶液(或甲醇)600 μl，內標(400 mg·L-1)100 μl，渦旋 3 min，12 000 r·min-1離心 5 min，取上清液。

2.2.2 透析外液 除不加內標外，其他同“2.2.1”項下操作。

2.3 方法學建立

2.3.1 專屬性實驗 通過比較大鼠空白血漿(或空白透析液)、空白血漿(或空白透析液)加對照品和給藥透析平衡后透析內液(或透析外液)的色譜圖，來考察分析方法的專屬性，結果表明，血漿和透析外液中內源性物質及黃芩提取物中的其它組分與指標化合物分離度良好，不干擾測定(Fig 1)。

2.3.2 標準曲線的繪制 分別精密稱取黃芩苷、漢黃芩苷、漢黃芩素、千層紙素A對照品適量，用色譜甲醇配制成濃度分別為994、422、135和107 mg·L-1的對照品儲備液。各精密吸取適量，分別配制兩組6個不同濃度的混合對照品溶液(內、外液)。取大鼠空白血漿和空白透析液各200 μl，按“2.2”項下方法處理樣品，記錄色譜圖和峰面積。采用加權(1/χ2)最小二乘法，以各成分峰面積與內標峰面積的比值(Ai/As)對質量濃度(Ci)進行線性回歸，求得回歸方程即為透析內液標準曲線;以各成分峰面積(Ai)對質量濃度(Ci)進行線性回歸，得回歸方程即為透析外液標準曲線(Tab 1)。

Fig 1 HPLC chromatograms of four major flavonoids in total flavonoids extract of scutellaria baicalensis Georgi inside and outside the dialysis membranes

Tab 1 Standard curves of four compounds in plasma

2.3.3 準確度與精密度 按“2.3.2”項下方法配制低、中、高3個濃度的模擬血漿樣品和模擬透析液樣品，按各樣品處理方法考察準確度和精密度。模擬血漿樣品的測定結果進行單因素方差分析，考察日內和日間精密度(RSD)，準確度以相對誤差(RE%)表示，見Tab 2。

2.3.4 提取回收率 用空白血漿配制成低、中、高3個濃度的模擬血漿樣品，每一濃度6樣本分析，照“2.2”項下方法操作，峰面積記為A;同時，另以水代替血漿同法制備，峰面積記為B。以每一濃度兩種處理方法的峰面積比值(A/B)計算提取回收率，3種濃度下各成分的提取回收率分別為BL(66.1±3.0)%、WL(90.8±6.4)%、W(95.4±7.8)%、OA(93.6±4.6)%。同法測定內標的提取回收率為(91.7±2.0)%。

2.3.5 穩定性考察 分別考察模擬血漿樣品和模擬透析外液樣品在-20℃凍藏14 d、預處理后室溫放置和4℃條件下放置的穩定性。結果表明:血漿樣品中，黃芩苷-20℃凍藏14 d、室溫放置6 h和4℃放置24 h均穩定;平衡透析液中，黃芩苷室溫下不穩定，但在4℃條件下可穩定36 h。其余成分各條件下均穩定。

Tab 2 Validation of the intra-day and inter-day assays

2.4 血漿蛋白結合率的測定 將預處理過的透析袋(長度約10 cm)一端折疊，結扎，于另一端加入新鮮大鼠血漿2 ml，留一小段氣泡，后將其扎緊，懸浮于盛有20 ml含藥透析液(提取物濃度41.6、62.4和104 mg·L-1)的廣口瓶中，每濃度3樣本，置4°C的冰箱冷藏平衡(12 h)，精密移取內、外液200 μl，按“2.2”項下方法操作，分別測定透析袋內血漿藥物濃度(總濃度Dt)和透析外液中藥物濃度(游離藥物濃度Df)，根據公式:血漿蛋白結合率=(Dt– Df)/Dt×100%計算各指標成分的血漿蛋白結合率(Tab 3)。數據應用F檢驗驗證其方差齊性后，采用SPSS 13.0軟件進行方差分析，結果表明，黃芩苷和漢黃芩苷在大鼠血漿中的蛋白結合率存在質量濃度依賴性(P＜0.01)，漢黃芩素和千層紙素A則不存在質量濃度依賴性(P＞0.05)。

Tab 3 Protein binding rates of 4 compounds in plasma of rats(n=3)

3 討論

平衡透析法原理簡單，操作方便，是經典和常用的測定方法［6-7］，但由于平衡透析時間長，須考察藥物的穩定性。因此，對黃芩苷穩定性因素的考慮是方法建立的關鍵。本研究表明，黃芩苷在透析液中的降解速率，提取物給藥比單體給藥明顯降低，且呈現溫度依賴性，在4℃條件下可穩定36 h。操作中為防止樣品在處理過程中降解，所有樣品均在冰浴上處理，低溫渦旋、離心、測定(4℃)，所用樣品管預先置于-20℃，試劑于4℃冰箱中保存備用。

本研究發現，黃芩提取物中，黃芩苷、漢黃芩苷、漢黃芩素、千層紙素A 4個成分與大鼠血漿有較高的結合率(＞80%)。其中，黃酮苷類成分(黃芩苷和漢黃芩苷)隨著藥物濃度的增加，蛋白結合率呈下降趨勢，推測其可能隨給藥劑量的不同有較大差異，而黃酮苷元(漢黃芩素和千層紙素A)則是非呈現濃度依賴性，提示黃酮苷和苷元由于結構和極性不同，其蛋白結合率亦有較大差異。

藥物經吸收進入血液后部分呈游離的分子狀態，部分則與血漿蛋白質可逆性結合，只有游離的藥物可以發揮藥效。當游離的藥物從組織或血液中清除后，部分結合藥物可與血漿蛋白質解離，從而彌補游離藥物。藥物與血漿蛋白質的可逆性結合不僅影響其代謝動力學、作用強度與作用時間，而且往往與藥物的作用機制、藥物相互作用等密切相關，因此，本研究可為含黃芩的復方及其組分(群)配伍研究提供基礎數據。

［1］ 國家藥典委員會.《中國藥典》Ⅰ部［S］.北京:化學工業出版社，2010:282-3.

［1］ Chinese PharmacopoeiaCommission.Chinese pharmacopoeia，Volume Ι［S］.Beijing:Chinese Medical Science and Technology Press，2010:282-3.

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［2］ Wang N.Experimental study on antimicrobial effects of active principle from Chinese traditional medicine astragalus membranaceus bge and scutellaria in vitro［D］.Yanshan Univ，2009.

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［3］ Zhou L，Ju W Z，Liu Z X，et al.Determination of plasma protein binding rate of multicomponent in Dengzhanxixin injection［J］.Chin Pharmacol Bull，2011，27(5):719-22.

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