白藜蘆醇對大鼠海馬CA1區誘發癲癇樣放電的影響

尤竹燕，王斌生，解 敏，李 珍，王烈成

(1.安徽醫科大學基礎醫學院生理學教研室，安徽合肥 230032;2.浙江大學醫學院血液細胞生物學實驗室，浙江杭州 310058)

癲癇是由多種原因引起的局部腦區神經元群異常放電所致的行為和功能異常的發作性慢性中樞神經系統疾病。顳葉癲癇(temporal lobe epilepsy，TLE)是臨床上最常見的癲癇類型，但由于目前對其機制還不是很明確，因此給它的治療帶來很大困難。癲癇的藥物防治目前研究進展緩慢，使用經典的抗癲癇藥物如苯妥英鈉、丙戊酸等可有效地控制部分癲癇發作，但仍有20%～25%癲癇患者經正規抗癲癇藥物治療后難以控制，發展成為慢性或難治性癲癇。另外，由于目前經典的抗癲癇藥物在藥動學和藥理學上均有缺陷，因此臨床上一直在找尋新型的抗癲癇藥物。白藜蘆醇(Res)是多種植物在遭受損傷、紫外線照射和真菌感染時合成的一種抗菌素［1］，具有多酚結構，并具有抗氧化、清除自由基、抗癌、抗誘變、抗衰老和降血脂等方面的作用。目前認為，Res對神經元有一定的營養、損傷修復和保護作用［2］，近年來，Res對癲癇的治療也逐漸引起了關注［3］。本研究采用離體腦片場電位記錄技術，通過在灌流腦脊液中加入不同濃度的Res，觀察并分析Res對大鼠海馬CA1區癲癇樣活動的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 普通級Wistar大鼠，♂，體質量200～240 g，由南京醫科大學實驗動物中心提供。

1.1.2 試劑 KA、bicuculline、Res均購自 Sigma公司，水合氯醛、戊巴比妥鈉購自中國醫藥集團上海化學試劑公司。

1.1.3 儀器 SN-2腦立體定位儀(日本 Narishige);Strong 90顱骨鉆 (韓國 Saeshin公司);NVSLM1振動切片機(美國WPI);P-97微電極拉制儀(美國Sutter);Model 3000 AC/DC差分放大器(美國A-M systems);Master-8生物電刺激器(以色列A.M.P.I.);powerlab 8/30 數據采集分析系統(澳大利亞ADInstruments)。

1.2 方法

1.2.1 TLE動物模型建立 大鼠經水合氯醛(350 mg·kg－1)腹腔麻醉后，固定于立體定位儀上，暴露顱骨，按大鼠立體定位圖譜［4］確定右側海馬CA3區注射靶點(AP:－4.0 mm，ML:4.4 mm，DV:3.8 mm)，用微量注射針注入 2.5 ～3 μl KA(0.4 g·L－1)，注射15 min，留針 10 min，術后縫合頭皮。大鼠急性發作等級參照Racine標準分級［5］，達到Ⅳ級及以上視為建模成功，模型大鼠在手術后2～4周進行細胞外場電位記錄。

1.2.2 離體腦片制備 大鼠用2%戊巴比妥鈉麻醉后迅速斷頭取腦，置于持續給予95%O2和5%CO2混合氣的4℃人工腦脊液(artificial cerebrospinal fluid，ACSF)中。待腦組織冷卻后按水平切面切成400 μm厚的腦片，并將其移至含(30 ±2)℃ ACSF的孵育槽中，持續通入混合氣，孵育1～2 h。ACSF成分 (mmol· L－1)包 括:NaCl 124，KCl 4.5，NaH2PO41.6，MgCl22.1，CaCl22.7，NaHCO326，Glucose 10，pH調定在7.4左右。

1.2.3 場電位記錄 將孵育的腦片移至記錄槽，持續灌流95%O2和5%CO2混合氣飽和的ACSF，灌流速度2 ml·min－1，溫度32℃。刺激電極為雙極鎢絲電極，通過高倍顯微鏡及定位儀的輔助操作，將其置于輻射層Schaffer側支通路;記錄電極為內充2 mol·L－1NaCl的玻璃微電極，阻抗5～8 MΩ，置于CA1區錐體細胞層記錄群峰電位(population spike，PS)。刺激頻率0.033 Hz，波寬0.1 ms。由記錄電極引導的誘發電位經微電極放大器放大，輸入powerlab數據采集系統進行觀察、記錄和分析。藥物實驗通過腦片灌流給藥途徑，給藥前穩定記錄誘發電位30 min。

1.3 統計學處理 采用SPSS 13.0統計軟件分析，實驗結果以±s表示，組間均數用t檢驗進行比較。

2 結果

2.1 白藜蘆醇對正常大鼠海馬CA1區PS的影響電刺激離體海馬腦片Schaffer側支，在CA1區錐體細胞層通常可記錄到單個PS，見Fig 1A;在灌流正常腦片的ACSF中分別加入低、中和高劑量(分別為 5、15、50 μmol·L－1)的 Res，當含有相應濃度的Res持續灌流腦片20 min后記錄的PS分別為灌流前的(98.32±1.3)%、(97.29±2.9)%、(96.46±1.5)%，經統計學分析PS幅度均無明顯變化(n=8，P ＞0.05)。見 Fig 1B，Fig 1C 及 Fig 1D。

2.2 Bicuculline及KA誘發大鼠海馬CA1區癇樣放電活動的PS 用GABAA受體拮抗劑bicuculline(30 μmol·L－1)灌流正常海馬腦片 20 min 后可引起4～6個PS的癇樣放電活動，見Fig 2A;KA造模成功后所致的大鼠海馬腦片也可記錄到4～6個PS的癇樣放電活動，見Fig 2B。

2.3 不同濃度的白藜蘆醇對bicuculline所致大鼠海馬CA1區癲癇樣活動PS的影響

2.3.1 低、中劑量 Res對大鼠海馬CA1區誘發癲癇樣活動PS的影響 在正常海馬腦片灌流bicuculline 20 min的基礎上，再灌流低劑量的Res(5 μmol·L－1)20 min后，前4個PS幅度均無明顯變化，分別為灌流前的(99.61±3.1)%、(102.66±3.2)%、(98.91±3.2)%、(99.65±3.3)%(n=8，P ＞0.05;Fig 3A)。用中劑量的 Res(15 μmol·L－1)灌流海馬腦片20min后，前4個PS幅度也無明顯變化，分別為灌流前的(98.27±2.9)%、(97.60±4.8)%、(97.08±5.4)%、(100.40±4.6)%(n=8，P ＞0.05;見 Fig 3B)。提示腦片灌流 5 ～15 μmol·L－1的Res對bicuculline所致的CA1區癲癇樣放電活動沒有明顯的影響。

Fig 1 Effects of resveratrol on PS in rat hippocampal CA1 region(The arrow marks the stimulus artifact of PS)

Fig 2 PS of epileptiform discharges evoked by bicuculline(A)and KA(B)in rat hippocampal CA1 region

2.3.2 高劑量的Res對大鼠海馬CA1區誘發癲癇樣活動PS的影響 在正常海馬腦片灌流bicuculline 20 min的基礎上，再灌流高劑量的Res(50 μmol·L－1)20 min后，前4個PS幅度均出現明顯性降低，分別為灌流前的(70.13±5.4)%、(67.87±3.6)%、(63.09±3.5)%、(61.01±5.3)%(n=8，P＜0.01;Fig 3C);并且PS數目也明顯減少，為灌流前的(82.02±1.3)%(n=8，P ＜0.01;Fig 3D)。以上結果表明 50 μmol·L－1的 Res對 bicuculline 所致的CA1區癲癇樣放電活動有部分抑制作用。

2.4 不同濃度的白藜蘆醇對癲癇模型大鼠海馬CA1區PS的影響 在顳葉癲癇模型大鼠海馬腦片上，用低劑量的Res(5 μmol·L－1)灌流海馬腦片20 min后，前4個PS幅度均無明顯變化，分別為灌流前的(98.61±3.3)%、(96.55±4.9)%、(95.22±2.5)%、(98.49±3.1)%(n=6，P ＞0.05;Fig 4A);用中劑量的 Res(15 μmol·L－1)灌流海馬腦片20 min后，前4個PS幅度也無明顯變化，分別為灌流前的(100.52±1.3)%、(101.30±2.7)%、(102.68±3.1)%、(103.36 ±3.2)%(n=6，P ＞0.05，Fig 4B)。而用高劑量的 Res(50 μmol·L－1)灌流海馬腦片20 min后，前4個PS幅度均明顯降低，分別為灌流前的(84.39±5.4)%、(84.40±4.9)%、(83.88±4.8)%、(81.30±6.3)%(n=6，P ＜0.01;Fig 4C);PS數目也明顯減少，為灌流前的(84.58±2.4)%(n=6，P ＜ 0.01;Fig 4D)。提示 50 μmol·L－1的Res對癲癇大鼠海馬CA1區場電位異常放電有部分抑制作用。

3 討論

癲癇是由多種病因引起的慢性中樞神經系統疾病，各種癲癇發作的本質都是由中樞神經系統某些細胞群發生突然地、過度地、同步地異常放電所引起的行為異常，異常放電的確切機制至今尚未完全闡明。目前較一致的觀點是癲癇發病是因為中樞神經系統興奮性與抑制性不平衡所致。近年來的研究表明，這種興奮與抑制間的不平衡主要與突觸傳遞［6］、氧化應激［1］及受體介導［7］等的改變有關。

Bicuculline是大鼠海馬GABAA受體的拮抗劑，GABA是中樞神經系統抑制性遞質，其離子型GABAA受體的激活可增加神經元細胞膜的Cl－通透性，產生抑制性突觸后電位，發揮抑制效應［8］。通過海馬腦片灌流bicuculline可以使這種抑制作用減弱，并記錄到多個PS的癇樣放電活動(見Fig 2)。KA是從海人草中提取的一種外源性氨基酸，其化學結構類似于谷氨酸，是興奮性氨基酸 KA受體的特異性激動劑，具有很強的興奮作用。本實驗通過在大鼠海馬內微量注射KA對海馬產生興奮毒性，從而誘發癲癇，且此種模型與人類癲癇的病理變化和行為表現很相似［9－10］，通過腦片灌流的方式也可記錄到多個PS的癇樣放電活動(見Fig 2)。

Fig 3 Effects of resveratrol with low，middle and high dose on PS evoked by bicuculline in rat hippocampal CA1 region

本研究通過離體腦片的場電位記錄發現隨著白藜蘆醇灌流濃度增加到50 μmol·L－1對大鼠海馬CA1區誘發的癲癇樣電活動有部分抑制作用，Res不但能降低大鼠海馬Bicuculline誘發的癲癇樣電活動，且能降低注射KA的造成大鼠癲癇模型的海馬CA1區的癲癇樣電活動，提示一定濃度的白藜蘆醇對癲癇的異常放電有一定的抑制效應，這與我們以往在整體癲癇大鼠模型所觀察的結果一致［10］。Bicuculline和KA均可使大鼠海馬興奮性與抑制性神經元上受體表達失衡，興奮性神經元過度興奮，抑制性神經元大量死亡，從而使海馬處于過興奮狀態導致癲癇樣場電位出現多個群峰電位(PS)。Res能有效對抗KA誘導的癲癇大鼠海馬CA1、CA3和齒狀回(DG)門區神經元死亡［10］，同時Res也能有效抑制KA誘導的星形膠質細胞和小膠質細胞興奮［11］。本實驗室既往研究也發現 Res具有保護TLE大鼠的CA1和CA3a區神經元免受損傷的作用，并明顯地抑制MFS，降低了海馬內神經元同步化放電和癲癇自發發作的頻率，具有較好的抗癲癇作用［11］。Res不但能明顯地抑制KA誘導的慢性顳葉癲癇大鼠的癇樣自發發作，且對KA誘導的顳葉癲癇大鼠癲癇不同發作時期海馬興奮性/抑制性氨基酸遞質比例的失衡有一定的逆轉作用［12］。Gupta等指出Res能對抗KA誘導的癲癇大鼠海馬活性氧(ROS)水平的增加，而ROS可以使大鼠海馬興奮性神經元活性增加，推測Res通過降低大鼠腦內氧化應激水平抑制癲癇的發生［1］。另外，我們之前還發現癲癇大鼠CA1區多個PS的癲癇樣電活動可能是由于錐體細胞軸突回返形成的突觸聯系激活了NMDA受體，并和非NMDA受體共同介導，而NMDA受體主要參與癲癇樣電活動靠后的PS［13］。因此，Res可能通過調節NMDA受體的功能對CA1區誘發的癲癇樣電活動產生部分抑制作用。

Fig 4 Effects of resveratrol with low，middle and high dose on PS in hippocampal CA1 region of rat TLE model

綜上所述，白藜蘆醇可能通過改善突觸傳遞、降低氧化應激或者調節受體功能這些機制來產生抗癲癇作用，且白藜蘆醇可透過血腦屏障［14］，這也為臨床治療癲癇提供了依據。本研究雖然在實驗室之前研究的基礎上通過腦片灌流技術進一步揭示了白藜蘆醇的抗癲癇作用，但具體的作用機制亟待進行更深入的研究。

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