HPLC法測定大鼠血漿中色胺酮的濃度及藥代動力學參數

李 捷，繆 珊，王四旺，王劍波，謝艷華

(第四軍醫大學藥學院天然藥物學教研室，陜西西安 710032)

色胺酮(tryptanthrin)為吲哚喹啉類生物堿，其化學名稱為吲哚［2，1-b］喹唑啉-6，12-二酮(6，12-dihydro-6，12-dioxoindolo-［2，1-b］-quinazoline)，結構式見Fig 1。主要存在于馬藍(Strobilanthes cusia)、蓼藍(Polygonum tinetorium Lour)、菘藍(Isatis tinctoria L.)等產藍植物中，現也可通過微生物發酵或人工合成得到［1］。近年來藥理研究表明其具有抗菌、抗炎、抗腫瘤、抗瘧和殺蟲作用，特別是可以通過多種途徑對腫瘤細胞增殖有抑制作用。據報道，蓼藍中的色胺酮能誘導白血病細胞凋亡［2］;Kimoto等［3］也觀察了色胺酮在體外對多種人白血病細胞的殺細胞作用;另有研究表明，色胺酮在低濃度可誘導白血病細胞分化，高濃度可通過caspase-3或Fas抗原途徑誘導凋亡，從而引起細胞的死亡;Mu［4］研究發現呈濃度依賴性抑制培養的腫瘤細胞的DNA合成;Motoki等［5］發現，色胺酮通過絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)活化的下游區域來抑制肝細胞生長因子的生成，從而抑制腫瘤細胞的惡化、侵襲、生長和轉移;Sharma等［6］合成了多個色胺酮衍生物，并篩選這些化合物對體外8種、體內12種人類腫瘤細胞株的殺傷活性，結果顯示大多數化合物具有細胞毒活性;Koya-Miyata等［7］的實驗表明，通過預防性給予色胺酮，可降低腸道腫瘤的發生率;繆珊等［8］研究發現色胺酮還能明顯抑制 MCF-7細胞增殖并具有誘導細胞發生凋亡的作用;還能影響人白血病細胞株K-562細胞的增殖和凋亡［9］。但是，色胺酮在體內的藥動學研究鮮有報道。為給色胺酮的進一步研究和應用提供依據，本文采用HPLC法建立了大鼠血漿中色胺酮的測定方法，并測定大鼠灌胃給予色胺酮后經時血藥濃度，研究其在大鼠體內的藥代動力學特征。

Fig 1 Chemical structure of tryptanthrin(a)and internal standard cinnamaldehyde(b)

1 材料

1.1 儀器 日本島津高效液相色譜(HPLC)儀，配有LC-20AT二元泵，SPO-M20A型二極管陣列檢測器，SIL-10AF自動進樣器，CTO-10AS型柱溫箱;KQ-300VDE型雙頻數控超聲波清洗儀(昆山市超聲儀器有限公司);電子天平(德國賽多利斯);XK-96A快速混勻器(姜堰市新康醫療器械有限公司);TGL-16GB高速臺式離心機(上海安亭科學儀器廠);Scietnz 192高通量組織研磨機(寧波新芝生物科技股份有限公司);SIMENSBCD-601W無菌冷藏冷凍冰箱(博西華家用電器有限公司);Millipore超純水器(密理博上海貿易有限公司);IVC獨立換氣系統(上海邵豐實驗動物設備有限公司)。

1.2 試藥 桂皮醛對照品(批號110710-200212)購于中國藥品生物制品檢定所(純度均大于98%)，肝素鈉(西安阿爾寶生物技術有限責任公司)，色胺酮由西北大學生命科學院提供(純度大于98%)，乙腈(SK chemicals，Korea)，水為超純水，其他試劑均為分析純。

1.3 動物 SD大鼠，體質量(280±20)g，由第四軍醫大學試驗動物中心提供，許可證號SCXK-(軍)2007－007。

Fig 2 HPLC chromatograms of the assay

2 方法與結果

2.1 色譜條件 Kromasil C18色譜柱(4.6 mm×250 mm)，流動相為乙腈 －水(47∶53)，流速1.0 ml·min－1，檢測波長 251 nm，柱溫 30℃，進樣量 20 μl。

2.2 溶液配制

2.2.1 對照品溶液的配制 精密稱取適量色胺酮對照品，加入乙腈稀釋配制成質量濃度為585.6 mg·L－1的儲備液。精密吸取適量，用乙腈分別稀釋成濃度為 11.712、5.856、2.928、0.723、0.183 mg·L－1的標準系列溶液，均于4℃保存，備用。

2.2.2 內標溶液的配制 精密稱取桂皮醛對照品，用甲醇溶解并稀釋至質量濃度為20 mg·L－1，即得內標工作液，均于4℃保存，備用。

2.2.3 灌胃溶液的配制 稱取色胺酮原料藥適量，用0.5%CMC-Na溶液助懸，配制成濃度為5.6 mg·L－1的混懸液，灌胃時磁力攪拌，使呈均勻的混懸狀態。

2.3 血漿樣品預處理 取血漿樣品200 μl，加入內標桂皮醛溶液20 μl和乙腈500 μl，渦旋混合1 min，再在12 000×g離心15 min，取上清液，即得。

2.4 方法學驗證

2.4.1 專屬性考察 取大鼠空白血漿、空白血漿加對照品、灌胃后血漿樣品，按照“2.3”項下方法處理，進樣后所得色譜圖見Fig 2。結果表明，本實驗條件下，色胺酮與內標峰分離良好，無雜質干擾。

2.4.2 標準曲線的制作和最低定量限考察 分別吸取“2.2.1”項下的系列標準溶液20 μl，加入200 μl空白血漿中，配制成相當于色胺酮濃度分別為0.0183、0.0723、0.2928、0.5856、1.1712 mg·L－1的血漿樣品。按“2.3”項下操作，以血漿中色胺酮的質量濃度為橫坐標(X)，以色胺酮和內標峰面積的比值為縱坐標(Y)，用最小二乘法回歸運算，得到直線回歸方程為 Y=3.608 5X－0.082 1，r2=0.999。結果表明色胺酮質量濃度在0.0183～1.1712 mg·L－1線性關系良好。按以上條件測得血漿中色胺酮的最低定量限為0.02 mg·L－1。

2.4.3 準確度、精密度考察 按“2.3”項下操作，制備低、中、高 3個濃度(分別為 0.0732、0.2928、0.5856 mg·L－1)的質量控制樣品(Quality control QC)，每個濃度分別制備6個樣本，重復3個分析批，以當日的標準曲線計算QC樣品的測得濃度，與配制濃度比較，得到本方法的準確度和精密度。連續檢測3 d，結果表明，日內、日間精密度分別為2.15%～3.05%和4.62% ～6.80%。試驗數據表明，測定大鼠血漿中色胺酮的分析方法符合中國國家食品藥品監督管理局(State Food and Drug Administration，SFDA)有關的臨床前藥代動力學研究的指導原則要求。

2.4.4 穩定性考察 經考察低、中、高3個濃度(分別為0.0732、0.2928、0.5856 mg·L－1)色胺酮在反復凍融3次，－20℃貯存15 d，室溫放置4 h條件下的RSD分別在3.54% ～8.77%、3.79% ～9.05%、4.21% ～9.20%(n=6)，說明在測定條件下樣品穩定。

2.4.5 提取回收率 以對照品溶液配制方法，配制成色胺酮低、中、高 3個濃度(分別為 0.0732、0.2928、0.5856 mg·L－1)的對照品溶液，再取大鼠空白血漿200 μl，用一定濃度的色胺酮對照品配制成相應濃度的色胺酮血漿樣品，按“2.3”項下操作，每一樣品進行6樣本分析，以血漿中色胺酮的峰面積與對照品溶液的峰面積的比，評價本方法的提取回收率。色胺酮在低、中、高3個濃度下的血漿樣品提取回收率分別為97.04%、95.26%和97.89%。結果見Tab 1。

Tab 1 Recovery of the assay for tryptanthrin in rat plasma(±s，n=6)

Tab 1 Recovery of the assay for tryptanthrin in rat plasma(±s，n=6)

Plasma concentration/mg·L－1Extraction recovery RSD/%0.0732 95.26 ±1.04 1.08 0.2928 97.04 ±0.56 0.58 0.5856 97.89 ±9.48 0.49

2.5 色胺酮在大鼠體內的藥代動力學

2.5.1 樣本的采集與處理 SD大鼠♀♂各5只，實驗前適應性喂養2 d，給藥前12 h至實驗期間禁食不禁水。按56 mg·kg－1單劑量灌胃［10］，分別于給藥前和給藥后 1、2、3、4、6、8、10、12、23 h 眼眶取血0.5 ml，置于肝素化PE管中，輕微振搖后4 000×g離心15 min，取血漿于－20℃保存，備用。

2.5.2 血藥濃度-時間曲線關系及藥代動力學參數 灌胃給藥后，色胺酮在♀♂大鼠體內的平均藥時曲線見Fig 3。血藥濃度數據采用DAS 2.1.1軟件進行分析，色胺酮的體內過程符合二室開放模型，以藥物半衰期(T)、達峰濃度(Cmax)、達峰時間(Tmax)和藥時曲線下面積(AUC)等參數表征該藥物的藥動學特征，結果見Tab 2。

Tab 2 Main pharmacokinetic parameters of tryptanthrin after oral administration at a single dose of 56 mg·kg-1to female and male SD rats(±s，n=5)

Tab 2 Main pharmacokinetic parameters of tryptanthrin after oral administration at a single dose of 56 mg·kg-1to female and male SD rats(±s，n=5)

Parameters Unit Female Male Mean SD T Mean SD 1 2β h 10.73 14.28 10.17 15.79 K21 h－1 0.221 0.198 0.323 0.238 K10 h－1 28.25 54.74 3.421 3.587 K12 h－1 0 0 0 0 Cmax mg·L －1 1.887 1.093 2.620 0.538 Tmax h 5.200 1.095 4.600 1.342 MRT0→∞ h 9.041 2.176 8.310 2.236 Vz/F L·kg－1 37.68 42.75 34.78 30.92 T h 1.503 0.877 1.279 0.285 T 1 2α 1 2z h 4.314 2.610 5.597 4.694 AUC0→∞ mg·h·L －1 12.51 5.285 14.70 3.310 CL L·kg－1·h－15.752 2.960 3.982 0.999

Fig 3 Mean plasma tryptanthrin concentration versus time profiles after oral administration at a single dose of 56 mg·kg-1 in male(A)and female(B)SD rats(n=5)

3 討論

優化HPLC色譜條件時，比較了流動相不同比例的甲醇 － 水［11－12］、乙腈 － 水，結果乙腈 － 水(47∶53)時內標物和色胺酮的保留時間恰當，峰形良好，血漿內源性物質及其他雜質不干擾樣品的分離測定。檢測波長的選擇時，對色胺酮進行全波長掃描，結果251 nm時吸收最大，最終確定251 nm為檢測波長。內標選擇時，曾試過靛藍和靛玉紅做內標［13］，但由于在相同的色譜條件下，較短時間內很難得到理想分離度和峰形，而桂皮醛的色譜行為與色胺酮相似，在較短時間內能很好的分離，并且提取回收率相近，故選擇桂皮醛為內標。

樣品制備時，比較了甲醇沉淀蛋白和乙腈沉淀蛋白，分別用乙酸乙酯、三氯甲烷萃取后4 000×g離心，結果在色譜峰中均有保留時間較長的色譜峰影響當前樣品或下一樣品的分析。后又改用500 μl乙腈沉淀蛋白，并直接12 000×g高速離心，結果樣品中被測峰和內標峰分離度均較好，并且對當前樣品和下一樣品均沒干擾，故終確定了文中的處理方法。經在藥代動力學研究中的應用，驗證了本文所建色胺酮HPLC的檢測方法在非臨床藥代動力學研究中的適用性，為其非臨床藥代及毒代動力學等安全性研究提供了可靠的分析方法。

考察擬開發新藥是否有發展前途，優良的藥代動力學參數是重要的指標之一。從實驗結果看，灌胃給予色胺酮后，其在♀和♂大鼠體內的Tmax均較大，分別為5.2 h和4.6 h，T12分別為4.3 h和5.6 h，提示色胺酮在大鼠體內吸收和消除均較緩慢;K12，K10，K21分別表明色胺酮主要從中央室消除和從周邊室向中央室轉運，并且分布廣泛;表觀分布容積(AUC0→∞)分別為 12.5 和 14.70 mg·h·L－1，也提示色胺酮在大鼠體內分布廣泛。血藥濃度－時間曲線數據顯示，色胺酮能在血液中較長時間保持一定血藥濃度，屬于一種長效機制，但是否會引起長期蓄積毒性反應，還有待于今后深入研究。

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