槲皮素對大鼠腦膠質瘤抑瘤作用的體內實驗研究

郭二坤 郝亮 梁朝輝 申海龍 李玉萍 馬東進 焦保華

腦膠質瘤是神經系統最常見的原發性腫瘤，其發病率占顱內原發腫瘤的 44.7%［1］，其惡性程度高，手術治療后易復發，且致死、致殘率均較高，對患者生命及生活質量造成極大威脅。化療是腦膠質瘤治療的重要補充，槲皮素作為一種黃酮類化合物，多項研究［2－4］顯示槲皮素對多種腫瘤的生長具有抑制作用，是目前最強的抗腫瘤藥物之一。增殖細胞核抗原 （proliferating cell nuclear antigen，PCNA）作為一種調節細胞增生的核蛋白，直接參與腫瘤細胞增殖過程中的DNA復制，能夠準確有效的反映腫瘤細胞的增殖能力，在腫瘤增殖活性的研究中被廣泛應用［5］。 國內學者［6］有報道槲皮素對大鼠腦膠質瘤C6細胞具有抑制增殖及促進凋亡的作用，但槲皮素對C6大鼠體內腦膠質瘤是否具有抑制增殖的作用？本實驗通過建立C6大鼠腦膠質瘤模型，探討槲皮素對C6大鼠腦膠質瘤的抑瘤作用及其作用機制。

1 材料與方法

1.1 研究對象 雄性SD大鼠35只（河北醫科大學試驗動物中心）；C6腦膠質瘤細胞株 （天津醫科大學總醫院提供）。藥品和試劑：槲皮素注射液（河北醫科大學藥學院）；順鉑（CDDP，山東齊魯制藥廠）；PCNA鼠抗 IgG單克隆抗體 （Santa Cruze公司）；MRI掃描儀（MiniMR?60實驗動物核磁共振成像儀，上海紐邁電子科技有限公司）。

1.2 細胞培養及細胞懸液制備 將大鼠C6腦膠質瘤細胞復蘇，加入含10%已滅活胎牛血清的RPMI?1640 培養基（含 NaHCO32 g／L，青霉素 100 U／mL，鏈霉素 100 U／mL）中，將培養瓶放入含 5%CO2，37℃恒溫密閉細胞培養箱中培養，取10 μL對數生長期C6細胞，用紅細胞計數板光鏡下計數，調節濃度使毎10 μL含1×106個細胞，然后按1∶9加入0.4%臺盼藍等滲鹽溶液，1 min內確認C6膠質瘤細胞存活率＞95%。

1.3 大鼠腦膠質瘤模型的制作 鼠齡7周雄性大鼠，水合氯醛腹腔內麻醉，大鼠腦立體定向儀頭架固定頭部，兩耳針深入外耳道，剪去頭頂部毛發，消毒，鋪洞巾。剪開頭皮，逐層暴露至顱骨，確定前囟位置。囟中點前1 mm，矢狀縫右側旁開3.0～3.5 mm，接種部位為大鼠右側尾狀核，自接種點垂直進針，從接觸硬膜開始計算，進針深度約6 mm，后退1 mm，將微量注射器內10 μL細胞懸液 （含有約1.0×106C6細胞），緩慢注入，拔針后用骨蠟封閉，逐層縫合頭皮。給予3 d含抗生素的飲用水預防感染。接種后10 d，行強化頭部MRI，確定是否有腫瘤形成。將荷瘤鼠隨機分3組：對照組，槲皮素組，順鉑組。分別給予以下處理：①對照組：腹腔內注射二甲基亞砜（Dimethyl sulfoxide，DMSO）0.2 mL，生理鹽水1 mL，每日1次，共7次；②槲皮素組：每天腹腔內注射槲皮素50 mg／kg，生理鹽水1 mL，每日1次，共7次；③順鉑組：腹腔內注射DMSO 0.2 mL，順鉑1 mg／kg（溶于1 mL生理鹽水），每日1次，共7次。

1.4 抑瘤率的計算 每組大鼠行頭顱MRI檢查，記錄腫瘤體積。然后斷頭處死大鼠，切取腫瘤組織，4%多聚甲醛固定，測量腫瘤長短徑，按照公式計算各組抑瘤率。抑瘤率= （空白對照組腫瘤體積-治療組腫瘤體積）／空白對照組腫瘤體積 ×100%，抑瘤率≥30%為腫瘤對藥物敏感。其中腫瘤體積=a×b×π／6（a為測量的腫瘤短徑，b為腫瘤長徑）。

1.5 HE染色觀察 腫瘤組織10%甲醛固定，常規包埋蠟塊，切片進行HE染色，光鏡下觀察腫瘤細胞數量、密度及壞死情況。

1.6 透射電鏡觀察 4%戊二醛固定腫瘤組織，逐步固定、漂洗、脫水干燥后，超薄切片，在透射電子顯微鏡下觀察腫瘤組織超微結構。

1.7 免疫組化測定PCNA 常規包埋蠟塊，切片進行免疫組化 SP法染色，一抗濃度（1∶100），DAB顯色，蘇木精復染，封片，光鏡下觀察，結果以胞核或（和）胞質中出現棕黃色或褐色顆粒為陽性，光鏡高倍視野下（400×）陽性細胞數所占總腫瘤細胞數的百分率為PCNA標記指數。

1.8 統計學分析 應用SPSS 11.0，實驗所得數據以均數±標準差（）表示，采用t檢驗、方差分析及兩兩比較SNK?q檢驗進行統計學處理，檢查水準α=0.05。

2 結果

2.1 腫瘤體積和抑瘤率的比較 實驗中有3只大鼠死于腦出血，1例死因不詳，1例死于顱內感染，模型建立成功率85.7%（30／35），對存活的30只荷瘤鼠隨機分為3組繼續實驗。槲皮素組、順鉑組及對照組腫瘤體積分別為 （59.6 ± 5.4）mm3，（66.2 ±5.9）mm3和（101.1 ± 9.6）mm3（圖 1），槲皮素組治療效果優于順鉑組，具有統計學差異（t=10.61，P＜0.01）。計算槲皮素組和順鉑組的抑瘤率分別為 41.3%和 34.8%，均 ＞30%，顯示腫瘤對兩種治療均敏感。

2.2 HE染色觀察 對照組C6膠質瘤內可見生長活躍的腫瘤細胞密集成群，瘤細胞異型性明顯，細胞核大深染，核分裂像多見。順鉑治療組腫瘤細胞數量較對照組減少，圍繞增生小血管或壞死灶云集在一起呈花環狀。槲皮素組C6膠質瘤細胞生長密度較對照組降低，細胞體積變小，細胞核形態相對規則，有大片壞死，并可見核固縮的凋亡細胞（圖 2）。

2.3 透射電鏡觀察 對照組C6膠質瘤細胞核呈不規則形狀，細胞核大，可見核切跡，細胞胞膜結構完整。順鉑和槲皮素組C6膠質瘤細胞核固縮，染色質趨邊聚集，排列于核膜內側，呈早期凋亡改變，細胞胞膜結構消失（圖3）。

2.4 免疫組化觀察 PCNA陽性顆粒著色于細胞核，呈棕黃色。槲皮素組、順鉑組、對照組腫瘤細胞陽性細胞數分別為 42.2% ± 5.1%，50.0% ± 6.7%，79.6%±8.6%，治療組與對照組比較，具有統計學差異（F ＝ 416.12，P ＜ 0.01），兩治療組間相比較，槲皮素組效果優于順鉑組 （q ＝ 55.12，P ＜ 0.05）（圖4）。

3 討論

膠質瘤是最常見的顱內原發性腫瘤，呈浸潤性、擴展性生長，手術難以根除，且多數膠質瘤對放射線不敏感，化療藥物又難以透過血腦屏障，目前尚缺乏滿意的治療手段，因此如何有效的控制甚至治愈膠質瘤仍是亟待解決的難題。

槲皮素是一種常見的黃酮類化合物，具有清除自由基及通過細胞內信號調節來減輕細胞氧化損傷的作用［7］。 國內學者［8］發現槲皮素對大鼠癲癇持續狀態所造成的神經元損傷能夠起到保護作用。研究者［2－4］發現槲皮素的抗腫瘤活性除基于上述機制之外，還參與基因表達、胞內信號級聯放大及酶活性調節等諸多機制，從而達到抑瘤作用。而最近的研究發現［9］，槲皮素能夠減弱肝臟炎癥反應，降低肝臟纖維化進程及防治肝癌的發生具有重要作用，并發現這一機制可能與槲皮素能夠使雙調蛋白及／表皮生長因子受體信號傳導機制失調有關。因此，發揮槲皮素潛在的抑瘤作用，成為人們進行抗腫瘤治療研究的熱點課題。

圖1 經頭顱MRI觀察各實驗組大鼠腫瘤大小

圖2 各實驗組荷瘤鼠HE染色比較（標尺20 μm；HE 100×）

圖3 透射電鏡觀察各實驗組荷瘤鼠超微結構

圖4 免疫組織化法檢測各實驗組腫瘤組織PCNA表達 （示陽性物質著色于細胞核，標尺 20 μm；DAB顯色 ×100）

文獻報道槲皮素可顯著抑制HeLa細胞增殖并誘導其凋亡，槲皮素與順鉑聯合應用具有協同效應［10］。本實驗中，我們通過給予荷瘤鼠不同的干預措施，結果顯示治療組膠質瘤體積較對照組顯著減小，電鏡及HE染色觀察到對照組膠質瘤細胞僅有輕度凋亡以及壞死，腫瘤細胞密集，增生毛細血管較多，而經槲皮素和順鉑治療后，瘤細胞增殖受到抑制，瘤細胞密度減小，且出現多量的凋亡細胞，并可見大片狀壞死灶。這說明了槲皮素對膠質瘤的生長的確存在抑制作用，在那么，它是通過什么機制來發揮抗腫瘤作用的？研究者將PCNA表達用于評估腦膠質瘤增殖活性的研究，并發現隨病理分級的增加，PCNA陽性表達率增高，表明PCNA的表達程度是評估腦膠質瘤增殖活性及其惡性程度的良好指標［11］。

另外，PCNA做為細胞周期內源性組織標記物，在正常腦組織中不表達，卻在膠質瘤中呈高表達，能夠反映腫瘤細胞增殖活性，對分析判斷膠質瘤增殖、分化及預后有重要意義［12］。因此，我們選取PCNA作為研究對象，對槲皮素抗腫瘤的可能作用機制進行了初步探討，結果顯示經槲皮素和順鉑治療后的膠質瘤組織中PCNA表達明顯降低，槲皮素組療效優于順鉑組，據此，我們可以推測槲皮素對大鼠顱內膠質瘤的抑制作用可能是通過抑制腫瘤細胞增殖及誘導腫瘤細胞凋亡作用實現的，但槲皮素抗膠質瘤生長的確切靶點及其更深入的分子生物學機制仍需要進一步探索。

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