蛛網(wǎng)膜下腔出血后早期海馬ADAMTS-1的表達與血腦屏障通透性的相關(guān)性研究

籍新潮 朱繼 呂國偉 萬偉峰 徐睿

蛛網(wǎng)膜下腔出血 （subarachnoid hemorrhage，SAH）后的早期腦損傷（early brain injury，EBI）是近幾年人們提出的一個新的研究方向，并認(rèn)為其可能是SAH患者病死率較高的重要原因，其中細胞外基質(zhì)的降解是EBI的重要組成部分。ADAMTS－1是一種新發(fā)現(xiàn)的金屬蛋白酶，可通過降解細胞外基質(zhì)參與多種病理生理過程，目前研究發(fā)現(xiàn)其與神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)生有密切關(guān)系［1］。本研究擬通過檢測實驗性大鼠SAH后ADAMTS?1的表達與血腦屏障通透性的改變，初步探討其在SAH后EBI中的作用。

1 材料與方法

1.1 研究對象 健康成年雄性SD大鼠108只，體質(zhì)量250～300 g。由重慶醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供。大鼠隨機分為假手術(shù)組（sham）組和SAH組，Sham組共18只，其中6只用于檢測ADAMTS?1蛋白水平，6只用于檢測ADAMTS?1 mRNA表達，6只用于血腦屏障檢測，前期實驗已證實sham組各時間點中ADAMTS?1的表達無統(tǒng)計學(xué)差異，故均于術(shù)后72 h處死。SAH組（90只）根據(jù)處理時間分為 6、12、24、48、72 h 5 個亞組，每亞組各 18 只大鼠，其中每組6只用于檢測ADAMTS?1蛋白水平，6只用于檢測 ADAMTS?1 mRNA表達，6只用于血腦屏障檢測。Anti?ADAMTS?1、 伊文氏藍（Evans blue，EB）均購于美國 Santa公司，Trizol試劑盒、RT?PCR檢測試劑盒購自Takara公司。

1.2 SAH模型的制作 據(jù)文獻采用改良的視交叉前池注血法建立大鼠SAH模型［2］，SAH組從股動脈插管抽取自體動脈血300 μL，經(jīng)PE10導(dǎo)管在30 s內(nèi)緩慢注入蛛網(wǎng)膜下腔。Sham組動物按同樣方法向蛛網(wǎng)膜下腔注入等量生理鹽水。

1.3 ADAMTS-1的 mRNA 的檢測 ADAMTS?1 mRNA的檢測按Trizol試劑盒說明提取海馬組織總RNA。紫外分光光度法測定RNA的含量，瓊脂糖凝膠電泳檢測其完整性。采用兩步法RT?PCR試劑盒配置反應(yīng)體系。ADAMTS?1及GAPDH引物由Takara公司設(shè)計并合成。ADAMTS?1的 Left Primer：5′?GATAAGTGTGGCGTTTGTGGAG?3′，Right Primer：5′?GATGGTCAGGGGTTCTTTGAGT?3′，擴增片斷為336 bp。 內(nèi) 參 GAPDH 的 Left Primer：5′?GTGCT?GAGTATGTCGTGGAGTCT?3′，Right Primer：5′?GT GGAAGAATGGGAGTTGCTGT?3′，擴增片段 610 bp。RT?PCR產(chǎn)物在2%瓊脂糖凝膠上電泳，紫外燈下拍照，采用quantity?one圖像處理系統(tǒng)分析比較電泳條帶相對光密度值。

1.4 大鼠海馬組織ADAMTS-1的 Western-Blotting分析 取大鼠海馬組織100 mg，裂解、離心、定量。提取含30 μg蛋白的樣品進行SDS?PAGE凝膠電泳。然后轉(zhuǎn)印至硝酸纖維膜，浸入封閉液中（37℃，2 h）。加入一抗并4℃冰箱孵育過夜，以TBST洗膜3次，每次10～15 min；加入辣根過氧化物酶標(biāo)記驢抗羊IgG （二抗），搖床上37℃孵育90 min，以TBST洗膜3次，加入新鮮配制的底物反應(yīng)液，輕搖至顯色后，去離子水漂洗終止顯色。成像后由 quantity?one軟件系統(tǒng)計算 ADAMTS?1和β?actin的光密度值，二者比值作為該樣品ADAMTS?1蛋白的表達量。

1.5 腦伊文氏藍含量的檢測 每組大鼠處死前經(jīng)10%水合氯醛麻醉，后經(jīng)股靜脈注射2%EB（5 mL／kg），60 min后向左心室灌注37℃生理鹽水，待流出液清亮后迅速斷頭取腦，分開右大腦半球，去除皮質(zhì)表面的蛛網(wǎng)膜、血凝塊及腦室脈絡(luò)叢，置于已知體積甲酰胺中，測定腦體積。繼續(xù)加甲酰胺至腦體積的5倍，置37℃恒溫水浴箱中，48 h后離心取上清液，紫外分光光度計波長632 nm比色測定OD值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算腦組織EB含量（mg／g腦濕重）。

1.6 統(tǒng)計學(xué)分析 運用SPSS 13.0處理，多組間均數(shù)的比較采用單因素方差分析，用LSD?t檢驗比較兩兩之間的差異，變量之間采用pearson相關(guān)分析。檢驗水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 大鼠海馬組織ADAMTS-1mRNA表達變化SAH后6 h、12 h組大鼠海馬組織ADAMTS?1mRNA表達與sham組比較無明顯差異 （6 h P=0.381，12 h P=0.263）；SAH 后 24 h 大鼠海馬組織 ADAMTS?1 mRNA表達開始增高（與sham組相比，P=0.011）；SAH后48 h海馬ADAMTS?1mRNA表達達到高峰（與 sham 組 相 比 ，P=0.004）；SAH 后 72 h ADAMTS?1mRNA活性較SAH后48 h開始下降，但仍高于Sham組水平（和Sham組相比P=0.017）。見圖 1、表 1。

2.2 大鼠海馬組織ADAMTS-1蛋白表達水平變化SAH后6 h、12 h組大鼠海馬組織ADAMTS?1蛋白表達與sham組比較無統(tǒng)計學(xué)意義（6 h P=0.461，12 h P=0.537）；SAH后 24 h大鼠海馬組織ADAMTS?1蛋白表達顯著增高 （與sham組相比，P=0.024）；SAH 后 48 h 海馬 ADAMTS?1 蛋白表達達到高峰（與 sham 組相比，P ＝ 0.007）；SAH 后 72 h ADAMTS-1蛋白活性較SAH后48 h開始下降但仍然維持在較高水平（與Sham組相比P＝0.019）。見圖 2、表 1。

2.3 SAH后大鼠血腦屏障通透性改變 與Sham組比較，SAH后6 h及12 h大鼠腦內(nèi)EB含量無明顯差異（6 h P ＝ 0.504，12 h P ＝ 0.436）； SAH 后 24 h大鼠腦內(nèi) EB含量顯著增加（P＝0.024）；SAH 后48 h及72 h大鼠腦內(nèi)EB含量仍較高，與Sham組相比有明顯差異（48 h P ＝ 0.017，72 h P ＝ 0.031）。見表1。

圖1 RT-PCR顯示Sham組及SAH后各時間點大鼠海馬組織ADAMTS-1mRNA的表達及相應(yīng)的GAPDH對照。

圖2 Western-blotting顯示sham組及SAH后各時間點大鼠海馬組織ADAMTS-1表達及相應(yīng)的β-actin對照。1：sham組；2：SAH后6 h 組；3：SAH 后 12 h 組；4：SAH 后 24 h 組；5：SAH 后 48 h 組；6：SAH 后 72 h組

表1 大鼠海馬組織ADAMTS-1蛋白、mRNA的表達和腦內(nèi)EB的含量

2.4 大鼠海馬ADAMTS-1蛋白表達與腦內(nèi) EB含量的相關(guān)性 SAH后6 h、12 h及Sham組大鼠海馬組織ADAMTS-1蛋白表達與腦內(nèi)EB含量不相關(guān)，分別為（r1＝ 0.307，P ＝ 0.238；r2＝ 0.312； P ＝0.267；r3＝0.418，P＝0.114），SAH 后 24 h、48 h、72 h兩者呈正相關(guān)，分別為（r4＝ 0.932，P＝0.021；r5＝0.951，P＝0.016； r6＝ 0.904，P＝ 0.027），SAH后ADAMTS-1蛋白表達與腦內(nèi)EB含量整體呈正相關(guān)（r＝0.936，P＝0.014）。

3 討論

自發(fā)性SAH是具有高病死率和高病殘率的臨床常見病，主要病因為顱內(nèi)動脈瘤破裂（約占80%）［3］。過去研究主要集中在再出血和腦血管痙攣及其相關(guān)并發(fā)癥上。想從這一途徑來降低死亡率，但是迄今仍沒有形成有效的治療方案來預(yù)防和減輕SAH后的腦損傷。近幾年，人們提出了一個新的研究方向，早期腦損傷（EBI）［4］并認(rèn)為是SAH患者死亡的重要原因，其指的是從初次出血那刻起到遲發(fā)性血管痙攣發(fā)生之前腦組織內(nèi)發(fā)生的一系列改變［5］。在EBI中有許多機制的改變，包括ICP升高、腦血流量（cerebral blood flow，CBF） 減少、腦灌注壓（cerebral perfusion pressure，CPP）降低、血管收縮、血管腔內(nèi)阻塞等，這些均可造成微循環(huán)障礙，而海馬區(qū)神經(jīng)元對缺血具有選擇性敏感，所以海馬成為腦損傷研究的一個典型腦區(qū)［6］。血腦屏障（BBB）的破壞是EBI的重要組成部分，其早期功能障礙促進了腦水腫的發(fā)生［7］。而導(dǎo)致BBB破壞的諸多因素中細胞外基質(zhì)的損傷尤為重要［8］。蛋白聚糖（PG）是細胞外基質(zhì)的基本骨架，在維持血腦屏障的完整性中起重要作用。ADAMTS-1是一種新發(fā)現(xiàn)的金屬蛋白酶，屬于分泌型蛋白，ADAMTS-1分泌后大多通過C末端3個TSP重復(fù)序列和間隔區(qū)錨定在細胞外基質(zhì)中［9－11］。ADAMTS-1 可以通過降解細胞外基質(zhì)蛋白［12－13］，如Versican、Brevican、Aggrecan，參與多種生理和病理生理過程。Cross AK等［14］研究顯示早期腦梗死時ADAMTS-1表達上調(diào)，并可能參與破壞BBB的完整性。

本研究采用改良的視交叉前池注血法建立大鼠SAH模型，應(yīng)用Western-Blotting和RT-PCR方法檢測大鼠海馬ADAMTS-1蛋白及mRNA表達變化，同時應(yīng)用甲酰胺浸泡法檢測大鼠腦內(nèi)EB含量以觀察血腦屏障的變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)大鼠SAH后24 h海馬ADAMTS-1蛋白及mRNA含量明顯升高，48 h達到高峰，并于72 h開始下降但仍高于sham組水平。研究同時觀察到從SAH后12 h到72 h大鼠血腦屏障通透性增高。大鼠腦內(nèi)EB含量自SAH后24 h開始升高，72 h仍維持在較高水平，SAH后48 h大鼠腦內(nèi)EB含量最高，SAH后早期大鼠腦內(nèi)EB含量與ADAMTS-1蛋白活性呈正相關(guān)，提示SAH后大鼠血腦屏障損害可能與ADAMTS-1降解細胞外基質(zhì)，導(dǎo)致血腦屏障結(jié)構(gòu)破壞有關(guān)。

本研究顯示細胞外基質(zhì)相關(guān)蛋白ADAMTS-1與SAH后BBB的損害有關(guān)，可能在SAH后EBI中發(fā)揮重要作用。本實驗還發(fā)現(xiàn)SAH后72 h ADAMTS-1活性仍維持在較高水平。因為ADAMTS是最近才被發(fā)現(xiàn)的一組酶，有關(guān)其生理及病理意義的認(rèn)識尚有一定的局限，ADAMTS-1在細胞外基質(zhì)降解致BBB損害中的作用程度有待進一步研究，但可以確定的是，作為其特異性的底物硫酸軟骨素蛋白聚糖（CSPGs）［15－16］，在腦中存在的主要類型有 Aggrecan，neurocan，versican，brevican，其通過CS鏈抑制神經(jīng)損傷修復(fù)中軸突再生的作用機制已較為明確［17－20］，所以 ADAMTS-1 可能在SAH后的EBI及神經(jīng)損傷后的修復(fù)兩個過程中均發(fā)揮了一定的作用。隨著其功能的日漸明了及其在EBI中的深入研究，ADAMTS-1將有可能成為SAH治療的新的靶點。

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