通絡益智散對血管性癡呆大鼠行為學、海馬病理學的影響*

孫紅旭，戴恩來

(甘肅中醫學院內科學教研室，甘肅 蘭州730000)

血管性癡呆(vascular dementia，VD)是指各種腦血管疾病引起的腦功能障礙而產生的獲得性智能損害綜合征，近年來已成為嚴重危害老年人身心健康的常見病、多發病，是老年期癡呆中最常見的類型之一。因此深入探討VD 的病理生理機制以及尋求較為理想的防治藥物具有重要意義。通絡益智散是甘肅中醫學院戴恩來教授治療VD 的有效經驗方，經過長期臨床應用療效顯著。為進一步探討該方對VD 的療效及作用機制，本研究以大鼠為研究對象，觀察該藥對大鼠行為學、海馬病理學的影響，以揭示其治療機制。

1 材料與方法

1.1 動 物

健康Wistar 雄性大鼠60 只，體質量(250 ±20)g，由甘肅中醫學院實驗動物中心提供，動物質量合格證號:SCXK(甘)2011－0001。大鼠在自然光線、20～25 ℃環境溫度下，自由進食進水，適應性飼養1 周。

1.2 藥品、試劑與儀器

通絡益智散藥物組成:紅芪、當歸、地龍、紅花、桃仁、葛根、核桃仁、石菖蒲、遠志，由甘肅中醫學院附屬醫院提供。硝普納粉針劑，50 mg/支，北京雙鶴現代醫藥技術有限公司產品，批號091011;尼莫地平，20 mg/片，山西亞寶藥業集團有限公司產品，批號090811。跳臺儀，自制，為30 cm×30 cm×60 cm的被動回避條件反射箱，用黑色塑料板分隔成3 間，底面鋪以銅柵，間距0.5 cm，可以通電，電壓強度由1 個變壓器控制;每間左后角置1 個高和直徑均為4.5 cm 的絕緣平臺(大鼠可停留在圓臺上回避電擊)。BCD－183 型可控低溫冰箱，青島澳柯瑪股份有限公司產品;AO 病理切片機;H.H.S 21－4 型電熱恒溫水浴鍋，上海醫療器械五廠產品;BX51/BX52型Olympus 系統顯微鏡，產地日本。

1.3 血管性癡呆模型的建立

參照藺心敬等［1］方法改進方法。將大鼠用100 g/L水合氯醛(0.35 g/kg)腹腔注射麻醉后，頸正中部常規消毒后切口，分離雙側頸總動脈，套“4”號絲線扣，拉緊絲扣，阻斷血流10 min 后松開絲扣使血液灌注10 min，共重復3 次;在距尾尖1 cm 處剪斷放血約1 mL;熱凝止血，第3 次再灌注后觀察30 min 后縫合皮膚，切口局部注射慶大霉素0.2 萬U，術后肌注青霉素0.2 萬U/d，連續3 d。假手術組大鼠只做麻醉，頸正中切口，分離雙側頸總動脈，但不阻斷CCA 及腹腔注射硝普鈉。整個造模過程中，用肛表密切觀察大鼠肛溫，保持肛溫在37 ℃左右，以防止低溫對腦缺血損傷的保護作用。

1.4 動物分組與給藥

從60 只雄性Wistar 大鼠中隨機選出10 只作為假手術組，其余50 只采用上述方法制造VD 模型。手術過程由于喉返神經受損、出血量過多、麻醉量太大而致6 只大鼠死亡，術后2 d 又相繼死亡4 只，后再無死亡，共剩余40 只大鼠。將此40 只大鼠隨機分為模型對照組、通絡益智散大劑量組、通絡益智散小劑量組及尼莫地平組，每組各10 只。手術后第8 天通絡益智散大劑量組以通絡益智散3.14 g/mL 藥液灌胃，31.4 g/(kg·d);通絡益智散小劑量組以通絡益智散0.785 g/mL 藥液灌胃，7.85 g/(kg·d);尼莫地平組以尼莫地平1 g/L 混懸液灌胃，0.010 g/(kg·d);假手術組、模型對照組給予相同劑量的生理鹽水。連續給藥21 d。

1.5 檢測指標

1.5.1 學習、記憶能力的檢測

造模后7 d 及術后4 周對大鼠進行跳臺儀訓練。訓練前先將動物放入箱中自由活動3 min，熟悉環境，然后將動物放置在圓臺上，接通銅柵電源(交流電，電壓36 V)，記錄動物3 min 內的錯誤次數(動物跳下圓臺次數)及受電擊總時間，作為學習訓練成績記錄。24 h 后直接將動物放置在圓臺上，記錄其從放入至第一次下臺受到電擊的時間(潛伏期)、5 min 后內錯誤次數及受到電擊總時間，作為記憶測試成績記錄。

1.5.2 海馬組織病理學觀察

術后第30 d 取材。用100 g/L 水合氯醛(0.35 g/kg)麻醉大鼠;經心灌注37 ℃生理鹽水50～100 mL，再先快后慢灌注含40 g/L 多聚甲醛的磷酸緩沖液(0.1 mol/L，pH 值7.2)100～400 mL，30 min 灌注完畢。取出整腦，在冰盤上去除腦膜和血管，分離海馬稱質量，在上述固定液內浸泡12 h。40 g/L 甲醛溶液固定腦組織，石蠟包埋、冠狀切片厚度(4 μm)，HE 染色，光鏡下觀察。HE 染色程序如下:二甲苯I、II 中各浸泡脫蠟10 min→質量分數100%、100%、95%、80%、70%乙醇各浸泡3 min→雙蒸水沖洗3 min→蘇木素染液中10 min→雙蒸水快速沖洗→質量分數1%鹽酸乙醇分色數秒→雙蒸水沖洗1 min→質量分數1%稀氨水返藍30 s→雙蒸水沖洗1 min→伊紅染液中1 min→雙蒸水沖洗30 s→質量分數70%、85%、95%、100%乙醇逐級脫水，各浸泡3 min→二甲苯透明，中性樹膠封片。

1.6 統計學方法

2 結 果

2.1 動物一般情況對比

模型對照組大鼠大多表現為毛發零亂、精神萎靡、進食減少、活動減少、行動遲緩;部分大鼠出現共濟失調、自發運動增多或自我及互相嘶咬等癥狀。各治療組大鼠在術后1 周內表現出與模型對照組類似的癥狀，但這些癥狀在1 個月內逐漸減輕。假手術組大鼠均未出現上述類似癥狀。

2.2 各組大鼠造模后跳臺測試結果對比

與假手術組對比，模型對照組大鼠的錯誤次數增多、受電擊時間延長、觸電潛伏期縮短，差別有統 計學意義(P＜0.01)，說明VD 模型成立。見表1。

表1 大鼠造模后跳臺實驗的學習和記憶成績對比 ±s

表1 大鼠造模后跳臺實驗的學習和記憶成績對比 ±s

注:與假手術組對比，＊＊ P＜0.01。

組 別 動物數學習成績5 min 錯誤次數/次 受電擊時間/s記憶成績5 min 錯誤次數/次 受電擊時間/s 潛伏期/s假手術組 10 2.77±0.50 20.77±2.77 1.23±0.37 13.85±2.09 70.31±8.14對照組 40 5.31±0.67＊＊ 38.54±4.16＊＊ 4.77±0.67＊＊ 30.62±2.83＊＊ 15.25±11.82＊＊

2.3 通絡益智散對血管性癡呆大鼠學習、記憶能力的影響

治療后大、小劑量的通絡益智散及尼莫地平組大鼠的跳臺錯誤次數和受電擊時間明顯少于模型對照組(P＜0.01 或P＜0.05)，同時大、小劑量的通絡益智散及尼莫地可使VD 大鼠潛伏期明顯增加(P＜0.01 或P＜0.05)。見表2。

表2 治療后各組大鼠跳臺實驗的學習和記憶成績對比 ±s

表2 治療后各組大鼠跳臺實驗的學習和記憶成績對比 ±s

注:與模型對照組對比，# P＜0.05，## P＜0.01;與通絡益智大劑量組對比，△P＜0.05，△△P＜0.01;與尼莫地平組對比，＊P＜0.05，＊＊P＜0.01。

組 別 動物數學習成績5 min 錯誤次數/次 受電擊時間/s記憶成績5 min 錯誤次數/次 受電擊時間/s 潛伏期/s假手術組 10 0.88±0.84## 8.38±2.30## 0.68±0.52## 7.25±2.19## 133.38±5.17#模型對照組 10 4.38±1.30＊△△ 51.88±5.75＊＊△ 2.88±1.72＊△ 50.38±5.94＊＊△ 43.00±3.92＊＊△通絡益智大劑量組 10 2.13±0.99## 24.75±3.92# 1.25±0.71# 14.75±2.65# 122.25±3.05#通絡益智小劑量組 10 2.50±0.93#＊ 34.75±3.74##＊ 1.13±0.99#＊ 33.13±10.49##＊ 88.63±10.74##＊尼莫地平組 10 2.75±1.03# 16.38±2.70## 1.25±0.89# 21.38±3.74## 62.63±7.87##

2.4 通絡益智散對血管性癡呆大鼠海馬組織病理形態的影響

假手術組:海馬CA1 區錐體細胞排列緊密，細胞核圓而大、核仁清晰，神經纖維密集、排列整齊，膠質細胞無增生。模型對照組:海馬神經細胞層次減少，排列稀疏，細胞核體積變小、核仁消失、深染，結構不清，成核固縮表現，膠質細胞增生形成多處結節。尼莫地平組:海馬CA1 區細胞排列較模型對照組整齊，形態較正常，水腫明顯減輕，海馬內核固縮現象減輕，膠質細胞輕度增生。通絡益智散大劑量組:與模型對照組相比改善明顯，與尼莫地平組比無明顯差異，海馬部位水腫明顯減輕，神經元輕度變性，呈現可逆性改變，膠質細胞輕度增生。通絡益智散小劑量組:與模型對照組相比改善明顯，與尼莫地平組略顯差異，海馬部位水腫減輕，神經元輕度變性，膠質細胞輕度增生。

3 討 論

3.1 通絡益智散對VD 大鼠學習、記憶功能的影響

動物錯誤次數、受電擊時間陽性率越低，觸電潛伏期越長，反映學習記憶力越強。跳臺反應實驗結果表明，血管性癡呆大鼠學習記憶能力明顯低于正常對照組，表明該方法造成的動物模型智力明顯下降，動物有一定“癡”表現。基于目前尚無與臨床十分吻合的血管性癡呆動物模型，而該法造模與血管性癡呆的病因病機基本相似，因此，以此模型為基礎來觀察通絡益智散的作用及其機制是可行的。

經用通絡益智散方藥治療后，動物反應能力明顯加強，即學習記憶能力明顯加強，揭示該方藥能明顯改善血管性癡呆動物的學習記憶能力，提高其智力，這與臨床應用該方藥能改善智力的情況相吻合。

3.2 通絡益智散對VD 大鼠腦組織病理形態的影響

海馬是大腦一個重要結構，極易受損并極具可塑性。海馬CA1 區錐體細胞與學習記憶密切相關亡［2］。目前認為，其神經元凋亡可能在VD 的發病過程中具有重要作用［3］。基于此，選擇海馬CA1 區作為研究智能的主要部位，有著極其重要的意義。

本研究發現VD 模型大鼠海馬組織結構受損，病理改變與行為學變化相一致，并伴有學習和記憶能力的下降，提示反復缺血再灌注所致海馬組織的神經元損傷是學習、記憶功能受損的形態學基礎。本實驗通過光鏡觀察大鼠腦組織海馬結構變化，發現通絡益智散能減輕海馬部位水腫、神經元的變性，抑制膠質細胞的增生從而防止VD 的發生。

［1］藺心敬，李呂力，王鐵建，等. 血管性癡呆大鼠模型的制備與評價［J］.中國比較醫學雜志，2006，16(12):733－735.

［2］Shaw CA，Petrik MS.Aluminum hydroxide injections lead to motor deficits and motor neuron degeneration［J］. J Inorg Bio－chem，2009，103(11):1555－1562.

［3］Fang M，Li J，Tiu SC，et al .N－methyl－D－aspartate receptor and apoptosis in Alzheimer's disease and multiinfarct dementia［J］.J Neurosci Res，2005，81(2):269－274.