扶正敗毒顆粒對膿毒癥大鼠腹腔感染所致腸損傷的保護作用

王丁超，高 翔，蘇秀平，王 靜，吳桂玲，張 韌，陳曉敏

(1.濮陽市中醫院，河南 濮陽457003;2.河南省中醫院，河南 鄭州450002)

嚴重的腹腔感染可以引起腸道的損傷，出現腸麻痹、腸道內毒素淤滯、腸屏障破壞、腸道內菌群失調以及腸道細菌移位，引起代謝紊亂、免疫功能障礙以及內環境平衡破壞和腸源性感染，腸損傷在膿毒癥的發生發展中起到推波助瀾的作用［1－2］。扶正敗毒顆粒為濮陽市中醫院院內制劑，由人參、生大黃、水牛角、生地黃、麥冬、玄參、石膏、知母、黃連、冰片等組成，具有解毒降濁、益氣化瘀功能，可以蕩滌胃腸積滯，抗菌排毒，促進腸道蠕動，保護腸屏障，改善腸道的缺血再灌注損傷，減少腸損傷帶來的腸源性內毒素血癥，下調炎性介質，保護靶器官。本實驗以膿毒癥大鼠為研究對象，觀察大鼠不同時間點的外周血白細胞計數、中性粒細胞比率、腸組織含水量、腸組織白細胞介素－ 1(IL-1)、腫瘤壞死因子－ α(TNF-α)表達變化，探討中藥復方扶正敗毒顆粒對膿毒癥大鼠腹腔感染所致腸損傷的保護作用。

1 材料與方法

1.1 動 物

青年SD 大鼠154 只，清潔級，雌雄各半，鼠齡3～4月，體質量(300 ±50)g，由河南實驗動物中心提供，動物質量合格證號:SCXK(豫)2009－0006。

1.2 藥品、試劑與儀器

扶正敗毒顆粒，由濮陽市中醫院中藥制劑室提供，批號20090605;烏司他丁，廣東天普生化醫藥股份有限公司產品，批號S19990050。IL-1 單克隆抗體(批號BA0131，BA0962)及TNF-α 單克隆抗體(批號BA0990，BA0544)，均由武漢博士德生物工程有限公司提供。PM－10AD 型光學顯微鏡，Olympus Optical Co.LTD 產品;JA1203 型電子天平，上海精科天平廠產品;XS－ 800i 型自動血液分析儀，日本希森美康公司產品。

1.3 分組與模型的建立

將SD 大鼠按隨機數字表法分為模型對照組、扶正敗毒顆粒組、烏司他丁組及扶正敗毒顆粒聯合烏司他丁聯合組(以下簡稱聯合組)，每組36 只，另設假手術組10 只。參考文獻［3－4］加以改良建立膿毒癥動物模型。以水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠;待完全麻醉后，仰臥位固定大鼠，頸部皮膚常規備皮、消毒;于頸外側下頜至心臟的中點作1 個約1 cm 的橫切口，鈍性分離皮下組織，暴露右側頸外靜脈;沿血管向近心端方向插入留置針約1 cm，將導管從留置針管與頸外靜脈夾孔中把心導管慢慢置入達右心房，結扎固定，導管末端經皮下隧道從頸后中央引出并固定于皮膚;管內注射125 U/mL 肝素0.5 mL 抗凝，插入置管針封閉導管;然后沿腹白線中段作3 cm切口，探查取出盲腸;用四號絲線距盲端1 cm 處結扎，用12 號針穿刺3 個孔，擠出少許糞便于腹腔內，回納盲腸，分層縫合腹腔。假手術組僅在頸部及腹部各做1 個切口，縫合。手術過程中保持大鼠肛溫(37.0 ±0.5)℃，保持室溫(26 ±1)℃。

1.4 給藥方法

造模后第1 日，假手術組、模型對照組、烏司他丁組用生理鹽水灌胃，扶正敗毒顆粒組、聯合組用扶正敗毒顆粒(36. 8 mg/100 g)灌胃(灌胃容積為1 mL/100 g)，每日灌胃1 次，連續7 d，直至取材;此外，烏司他丁組、聯合組大鼠分別于造模后第1 天腹腔內注射烏司他丁(1 萬U/kg)，假手術組、模型對照組、扶正敗毒顆粒組用同等容積的生理鹽水腹腔注射，每天1 次，連續7 d，直至取材。

1.5 檢測指標

1.5.1 外周血白細胞和中性粒細胞比率

在造模結束后第2，3，7 d 取材。取大鼠尾部靜脈血，用XS-800i 自動血液分析儀自動分析計數外周血白細胞(×109L－1)和中性粒細胞比率(%)。

1.5.2 腸組織含水量

稱取腸組織濕質量，然后放入恒溫箱(100 ±2 ℃)干燥，24 h 后取出，稱取干質量，計算腸組織含水量。計算公式:腸組織含水量=(腸濕質量－腸干質量)/腸濕質量×100%，以%表示。

1.5.3 腸組織TNF-α、IL-1 表達

采用免疫組織化學SP 法檢測。在400 倍光鏡下觀察，細胞膜、細胞漿呈棕色為免疫組化陽性。用Image－Pro Plus 5.1 專業圖像采集與分析系統采集圖像，并進行半定量分析。每張切片隨機選取不重疊的5 個視野拍照，測定其平均吸光度(A)及陽性細胞數，取其平均值代表各細胞因子的表達水平。

1.6 統計學方法

采用SPSS 13.0 統計分析軟件處理。計量資料數據以均數()±標準差(s)表示，組內差異比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用t檢驗。以P＜0.05 為差別有統計學意義。

2 結 果

2.1 扶正敗毒顆粒對膿毒癥大鼠外周血白細胞計數、中性粒細胞比率的影響

與假手術組對比，模型對照組各時間點大鼠外周血WBC 計數升高，差別有統計學意義(P＜0.01)。與模型對照組對比，扶正敗毒顆粒組、烏司他丁組及聯合組各時間點白細胞計數均降低，差別有統計學意義(P＜0.05，P＜0.01)。各藥物組7 d時的白細胞計數均較2 d、3 d 時下降，差別有統計學意義(P＜0.05，P＜0.01)，以聯合7 d 組下降尤為顯著。外周血中性粒細胞比率變化與白細胞計數變化呈正相關。見表1。

表1 各組大鼠外周血白細胞計數、中性粒細胞比率對比 ±s

表1 各組大鼠外周血白細胞計數、中性粒細胞比率對比 ±s

注:與假手術組比較，* P＜0.05，＊＊ P＜0.01;與模型對照組對比，# P＜0.05，## P＜0.01;與扶正敗毒顆粒組對比，△P＜0.05，△△P＜0.01;與2 d 組對比，＊ P＜0.05，＊＊ P＜0.01;與3 d 組對比，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01。

組 別 取材時間點 動物數 白細胞計數/(×109 L －1) 中性粒細胞比率/%假手術組6 4.38 ±0.88 62.16 ±0.00造模結束第2 d 6 12.07 ±1.27＊＊ 80.53 ±1.70＊＊3 d 6 15.88 ±1.78＊＊ 91.70 ±2.46＊＊7 d 6 14.58 ±1.57＊＊ 85.24 ±2.04＊＊▲造模結束第2 d 6 8.87 ±0.92 76.18 ±1.37 3 d 6 10.60 ±1.29## 82.35 ±1.69##7 d 6 9.17 ±1.25##＊＊▲▲ 73.21 ±2.26##＊＊▲▲造模結束第2 d 6 8.25 ±0.77 77.06 ±1.60 3 d 6 9.33 ±1.11 80.39 ±1.45 7 d 6 6.75 ±1.76#△△＊＊▲▲ 72.86 ±2.27#△△＊＊▲▲造模結束第2 d 6 7.07 ±1.70 74.11 ±1.22#3 d 6 5.63 ±1.36## 70.26 ±1.94##7 d 6 ##△＊＊▲▲ ##△＊＊▲▲模型對照組 扶正敗毒顆粒組 烏司他丁組 聯合組 4.98 ±0.9865.37 ±1.79

2.2 扶正敗毒顆粒對膿毒癥大鼠腸組織含水量的影響

與假手術組對比，模型對照組各時間點大鼠腸組織含水量升高，差別有統計學意義(P＜0.01)。與模型對照組相應時間點對比，各藥物組各時間點的大鼠腸組織含水量均降低，差別有統計學意義(P＜0.05，P＜0.01)。各藥物組7 d 時的含水量均較2 d、3 d 時下降，差別有統計學意義(P＜0.05，P＜0.01)，以聯合7 d 組下降尤為顯著。見表2。

表2 各組大鼠腸組織含水量對比 ±s

表2 各組大鼠腸組織含水量對比 ±s

注:與假手術組對比，* P＜0.05，＊＊ P＜0.01;與模型對照組對比，# P＜0.05，## P＜0.01;與扶正敗毒顆粒組對比，△P＜0.05，△△P＜0.01;與2 d 組對比，＊ P＜0.05，＊＊ P＜0.01;與3 d 組對比，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01。

/%假手術組組 別 取材時間點 動物數 含水量6 72.72 ±1.39模型對照組 造模結束第2 d 6 83.22 ±1.30＊＊3 d 6 87.41 ±1.05＊＊＊7 d 6 85.64 ±1.35＊＊結束第2 d 6 81.17 ±1.49 3 d 6 82.58 ±0.82 7 d 6 80.72 ±1.30##＊＊▲▲結束第2 d 6 80.39 ±1.44 3 d 6 83.29 ±1.51#＊7 d 6 80.10 ±1.15#＊＊▲▲結束第2 d 6 79.28 ±1.77#3 d 6 81.45 ±1.26##7 d 6 78.64±1.22##△＊＊▲▲扶正敗毒顆粒組 造模烏司他丁組 造模聯合組 造模

2.3 扶正敗毒顆粒對膿毒癥大鼠腸組織TNF-α、IL-1 表達的影響

假手術組腸組織少量TNF-α、IL-1 陽性表達。模型對照組2 d、3 d 和7d 時的腸組織TNF-α、IL-1表達均較假手術組增強，差別有統計學意義(P＜0.05，P＜0.01)。與模型對照組對比，扶正敗毒顆粒組、烏司他丁組的3d、7d 及聯合組各時間點TNF-α、IL-1 的表達均減弱，差別有統計學意義(P＜0.05，P＜0.01)。各藥物組3 d 時的表達均較2 d 時減弱，7 d 時的表達均較3 d 時顯著減弱，差別有統計學意義(P＜0.05，P＜0.01)，以聯合7 d 組尤為顯著。見表3。

表3 各組大鼠腸組織TNF-α、IL-1 陽性細胞表達對比 IOD，光密度單位，±s

表3 各組大鼠腸組織TNF-α、IL-1 陽性細胞表達對比 IOD，光密度單位，±s

注:與假手術組對比，* P＜0.05，＊＊ P＜0.01;與模型對照組對比，# P＜0.05，## P＜0.01;與扶正敗毒顆粒組對比，△P＜0.05，△△P＜0.01;與2 d 組對比，＊P＜0.05，＊＊P＜0.01;與3 d 組對比，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01。

組 別 取材時間點 動物數 腸組織TNF-α 腸組織IL-1假手術組6 2.89 ±1.07 2.19 ±1.62模結束第2 d 6 19.66 ±1.12 19.38 ±1.26 3 d 6 12.59 ±2.3* 12.37 ±1.22＊＊7 d 6 10.13 ±1.08＊＊▲ 10.38 ±2.38＊＊＊▲模結束第3 2 dd 6 6 12 9..7 6 7 8±±1 1..1 52 4####1 1 3 0..2 7 3 2±±2 2..9 3 5 1#7 d 6 8.01 ±2.27##＊＊▲ 8.33 ±1.58#＊▲模結束第2 d 6 14.23 ±2.53# 15.63 ±2.63#3 d 6 10.93 ±1.46# 10.29 ±2.99＊7 d 6 9.56 ±1.41##＊▲ 9.11 ±1.46＊＊▲模結束第2 d 6 7.49 ±1.77## 9.22 ±1.13##3 d 6 6.93 ±1.88## 8.16 ±2.24##△7 d 6 5.88 ±1.66##△△＊＊▲▲ 6.24 ±2.32##△△＊＊▲▲模型對照組 造扶正敗毒顆粒組 造烏司他丁組 造聯合組 造

3 討 論

膿毒癥屬中醫學“傷寒”、“溫病”的范疇，由于邪毒入侵(如嚴重感染、中毒、休克等)或各種創傷(如外傷、燒傷、燙傷、手術等)導致正邪交爭、正氣耗傷、邪毒阻滯而發病。正氣虧虛、濁毒內蘊、絡脈瘀滯是膿毒癥的主要病機之一。正氣不足、毒邪內蘊陷于營血，使絡脈氣血營衛運行不暢，而致毒熱、瘀血、濁毒瘀滯絡脈，進而使各臟器受邪而損傷，引發本病。本病的病機特點為本虛標實，本虛以氣虛為主勢以緩，標實則以濁毒(熱毒、瘀毒、濁毒)為主勢以急，虛、瘀、毒交互影響，形成惡性循環。故治療宜以清熱解毒、降濁化瘀為主，兼顧益氣扶正。解毒降濁，導毒邪下行，使熱清、瘀化、濁去，從而使邪去正安，機體陰陽平衡狀態得以恢復。扶正敗毒顆粒由人參、生大黃、水牛角、生地黃、麥冬、玄參、石膏、知母、黃連、冰片等組成。方中大黃既可解毒降濁以釜底抽薪，又可化瘀通絡，為君藥。人參扶正大補元氣并防大黃攻下之峻烈，水牛角清解營分之熱毒，寒而不遏，且能散瘀，二者共為臣藥。石膏配知母取白虎義，有清熱保津之功;水牛角配生地黃清熱涼血、活血散瘀，以防血與熱結;黃連苦寒，清熱解毒，以治氣營兩燔、氣血兩燔之證;麥冬、生地黃、玄參滋養陰液是為熱甚傷陰而設;以上共為佐使藥。諸藥配伍，共奏解毒降濁、益氣化瘀之功效。本研究顯示，經過扶正敗毒顆粒治療，膿毒癥大鼠外周血白細胞總數及中性粒細胞比例降低，提示扶正敗毒顆粒對膿毒癥大鼠具有明顯的抗炎作用。

IL-1 能夠引起多種炎癥因子的產生和釋放，TNF-α 是全身炎癥反應早期的重要炎性細胞因子，其大量釋放則對機體造成損傷，二者協同可促進血管內皮、白細胞黏附分子的表達，趨化中性粒細胞等炎癥細胞進入腸道病變部位，增加血管內皮通透性，加重多器官損傷［5－6］。因此，可以通過抑制IL-1、TNF-α 的釋放而減少全身的炎癥反應和多臟器損害，從而對機體起保護作用。本研究結果顯示，膿毒癥大鼠腸組織IL-1、TNF-α 的陽性細胞數和平均光密度均增高明顯，表明IL-1、TNF-α 參與了膿毒癥的病理損傷過程，可能在膿毒癥大鼠的病理生理中占有重要地位。扶正敗毒顆粒、烏司他丁及聯合用藥后明顯降低了IL-1、TNF-α 在腸組織的表達，聯合組效果尤為顯著，這可能與扶正敗毒顆粒、烏司他丁通過對機體內毒素的清除，降低細胞因子IL-1、TNF 的產生，抑制和減少炎性因子的合成和釋放，使其無法相互協同促進炎癥反應，從而能夠改善腸組織損傷。

綜上所述，促炎因子TNF-α 及IL-1 在腹腔感染所致腸損傷中發揮了重要作用。扶正敗毒顆粒能夠降低外周血白細胞計數及中性粒細胞比率，降低臟器組織中TNF-α、IL-1 表達水平以減輕臟器損傷，減輕了腸組織的含水量，對膿毒癥大鼠具有確切的治療作用。此為扶正敗毒顆粒防治膿毒癥性多器官功能障礙綜合征提供了參考。另外，此對探討中西醫結合治療膿毒癥的干預策略具有重要意義。

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