氯化鍶對去透明帶卵母細胞孤雌激活效果及孤雌胚胎體外發育體系的研究

何 允，肖 雄，鄧玉金，趙海龍，李躍民

(西南大學動物科技學院胚胎工程研究室，重慶 400715)

卵母細胞的激活是動物克隆技術中的關鍵步驟之一，應用于細胞核移植及孤雌胚胎干細胞分離培養等環節，可通過不同途徑實現[1]。其中SrCl2作為一種常用激活劑，能夠對MⅡ期卵母細胞進行化學激活[2]。在激活處理過程中，透明帶不為胚胎活化發育所必須[3]，且去透明帶卵母細胞孤雌激活率高于全胚細胞直接激活率[4]。故本實驗采用不同濃度SrCl2激活劑對去透明帶卵母細胞進行激活，在最適作用時間條件下討論濃度對激活效果及發育率的影響。此外本實驗對孤雌胚胎體外條件培養體系進行了優化，將常規培養液培養發育效果與添加LIF因子培養液培養發育效果進行了比較。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及主要試劑

實驗動物為6～8周齡性成熟昆明系小鼠，購自重慶市中藥研究所。

主要試劑:孕馬血清促性腺激素(PMSG)及人絨毛膜促性腺激素(hCG)為寧波第二激素廠生產，SrCl2、LIF因子及其他藥品均購自Sigma公司。

1.2 MⅡ期卵母細胞的獲取

雌性小鼠經腹腔注射PMSG10IU/只，48h后注射hCG 10IU/只。注射hCG18h后頸椎脫臼處死小鼠，常規外科方法無菌獲取輸卵管。所得輸卵管以M2液漂洗3遍后，撕破膨大部收集卵丘－卵母細胞復合體，以0.1%透明質酸酶37℃處理3～5min獲得卵母細胞。

1.3 卵母細胞去透明帶處理

將上述卵母細胞以0.5%鏈霉蛋白酶37℃處理1min，待透明帶分層膨脹后以內徑略小于透明帶的吸管輕輕吹打至透明帶脫落，所得裸卵細胞經M2液洗滌后放入37℃、5%CO2培養箱中備用。

1.4 不同濃度氯化鍶對去透明帶卵母細胞的孤雌激活

以 5mmoL/L、10mmoL/L、20mmoL/LSrCl2激活處理去透明帶卵母細胞6h。將激活后的卵母細胞移入DMEM培養液培養48h并記錄發育情況。

1.5 LIF因子對孤雌胚胎體外成熟的影響

以適宜濃度的SrCl2激活液對去透明帶卵母細胞激活處理6h，將激活的卵母細胞以DMEM培養液或添加10ng/mL LIF的DMEM培養液洗滌3遍，移入DMEM培養液或含LIF的DMEM液滴中培養48h并統計發育情況。

1.6 數據處理

試驗數據以“平均數±標準差”表示，采用SPSS13.0軟件進行單因素方差分析(One－Way－ANOVA)。

2 結果

2.1 不同濃度氯化鍶對去透明帶卵母細胞的激活效果

由表 1 可知，以5mmoL/L、10mmoL/L、20mmoL/LSrCl2對去透明帶卵母細胞進行6h激活處理，激活率分別為40.38%、46.00%、24.62%。10mmoL/LSrCl2卵裂率與5mmoL/LSrCl2差異不顯著(P＞0.05)，但發育到桑葚胚階段的細胞比率顯著高于5mmoL/L(44.00%vs28.85%，P＜0.05);兩組的卵母細胞卵裂率及桑葚胚率均顯著高于20mmoL/L(P ＜0.05)。

表1 不同濃度對小鼠去透明帶卵母細胞孤雌激活的影響

2.2 LIF因子對孤雌胚胎體外培養效果的影響

以10mmoL/L激活6h的卵母細胞用不同培養液培養48h后得到表2所示結果。常規DMEM培養液中有43.40%活化胚胎發育到桑葚胚階段，而在LIF+DMEM條件體系下達到了84.62%桑葚胚率，兩組相比差異顯著(P＜0.05)。

表2 LIF因子對孤雌胚胎體外培養效果的影響

3 討論

小鼠的卵母細胞透明帶韌性較大，質膜脆弱，使用0.5%鏈霉蛋白酶去除透明帶后能夠提高化學激活劑效率[5]，使SrCl2激活劑的Sr2+更容易通過細胞膜上Ca2+通道進入細胞;Sr2+進入細胞后經磷酸肌醇途徑置換內源性Ca2+，使細胞內游離Ca2+濃度上升，從而誘導人工激活卵母細胞[6]。SrCl2的激活效果受濃度與作用時間因素影響[7]，本實驗結果表明:經10mmoL/LSrCl2處理的卵母細胞發育更易發育至桑葚胚，效果優于5mmoL/L及20mmoL/L實驗組。

LIF因子通常由成纖維細胞(MEF)飼養層分泌，且其分泌量隨MEF細胞傳代數增加而減少[8]。6代以后的MEF細胞幾乎不再分泌LIF，雜質細胞數量增加。MⅡ期卵母細胞經孤雌激活后不依靠飼養層就可進行體外培養，直接向DMEM培養液添加母源性LIF因子能夠顯著提高胚胎發育率，并強化其活性[9]。有研究表明，卵母細胞在2～10ng/L濃度LIF最適作用于其體外成熟率[10]。在本實驗中，去透明帶卵母細胞經SrCl2激活劑作用后，以LIF+DMEM培養48h能夠達到84.62%桑葚胚發育率。

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