冠心病血瘀證的血清差異蛋白質組學研究＊

周倩倩 李治國 黃 力

冠心病屬于中醫學“胸痹”、“心痛”范疇，血瘀證是冠心病中醫證候辨證中較常見的癥候類型。蛋白質組學技術在中醫藥領域中的應用，為中醫證型實質的研究提供了新的方法。本研究采用蛋白質組學的相關技術方法，分析冠心病血瘀證患者和健康人群之間血清蛋白質的差異，以期發現與冠心病血瘀證相關的特異性蛋白質。

1 材料與方法

1.1 對象與分組

冠心病血瘀證患者（疾病組）均為2009年9月～2010年11月中日友好醫院中西醫結合心內科門診及住院病人8例，男女各4例，平均年齡69.50±9.78歲；健康人群（對照組）8例，均來自北京中醫藥大學體檢正常的健康志愿者，男3例，女5例。病例組西醫診斷符合 WHO／ISEC制定的《缺血性心臟病的命名和診斷標準》［1］，中醫診斷標準符合中國中西醫結合學會心血管病專業委員會于1990年修訂的《冠心病中醫辨證標準》［2］，并參考中國中西醫結合學會活血化瘀專業委員會于1986年制定的血瘀證診斷標準［3］。對照組無糖尿病、高血壓、高脂血癥、腎臟疾病及外周血管病變；排除已發生心肌缺血而目前處于穩定期的患者，包括經冠狀動脈造影證實的冠狀動脈粥樣硬化性心臟病或陳舊心肌梗塞，或以前曾行經皮冠狀動脈介入治療（PCI）或冠狀動脈搭橋術后患者。

1.2 主要實驗試劑和儀器

固相 pH 梯度干膠條（pH3－10NL，24cm）、IPG buffer（pH3－10）、二硫蘇糖醇（DTT）、SDS、Tris均購自美國Amersham Bioscience公司；碘乙酰胺、考馬斯里亮藍G－250購自美國Amresco公司；四甲基乙二胺（TEMED）、過硫酸銨（AP）購自美國Sigma公司。

IPG phorTM等電聚焦儀（美國Amersham Pharmacia Biotech公司），Ettan DaltTwelve垂直電泳系統（美國Parafilm公司），ImageScannerⅢ透射掃描儀、Labscan掃描控制和分析前處理軟件（美國GE Healthcare公司），PD－Quest圖像分析軟件（美國Bio－Rad公司），MALDI－TOF－MS質譜儀（美國UltraFlexⅢTOF＆TOF／TOF，Bruker Daltonics公司）。

1.3 血清標本的采集和電泳

清晨采集兩組人群外周靜脈血3ml于非抗凝真空采血管中，3 000rpm離心10min，分離血清，于－80℃冰箱內貯存備用。采用Bradford法測定各血清樣本的蛋白濃度后進行雙向凝膠電泳。第一向固相PH梯度等點聚焦（IEF）：于含1mg蛋白的血清樣本中加入1%IPGbuffer，水合液稀釋至450μl，混勻上樣，水化合等點聚焦在20℃進行，總電壓為90 000Vh。 具 體 參 數 如 下：30V12h，250V1h，500V1h，1 000V1h，8 000V30min，8 000V 至90 000 Vh。第二向垂直SDS－PAGE電泳：平衡后的IPG膠條移至12%SDS－PAGE膠上端，加入SDS電泳緩沖液，電泳條件為25℃，2W／gel電泳30min，然后按每塊膠17W的恒功率電泳，直到溴酚藍指示線到達凝膠底邊為止。2－DE凝膠固定后以考馬斯亮藍G－250染色。

1.4 圖像分析和質譜鑒定

凝膠脫色后經LabScan和ImageScanner透射掃描，運用PD－Quest軟件對各組凝膠圖譜進行蛋白點檢測、標準化、匹配、統計學處理，找尋差異表達的蛋白質點。采用 MALDI－TOF－MS進行質譜分析，獲得肽質量指紋譜（由軍事醫學科學院生物醫學中心完成），運用 Mascot軟件搜索Swissprot和NCBInr數據庫，得到差異蛋白質的相關信息。

2 結 果

2.1 兩組2－DE結果

對兩組中單個血清樣本分別進行雙向凝膠電泳分離，分兩次進行，第一次3例／組，第二次5例／組，兩組各獲得8個凝膠圖譜，所得典型的雙向凝膠電泳圖如圖1所示。圖譜信息經PD－Quest軟件分析顯示，對照組及病例組的平均蛋白質點數分別為153.60±27.57和146.60±19.99，通過背景消減、匹配分析，共得到12個差異蛋白質點，其中，部分差異蛋白質點的局部放大圖見圖2。

圖1 典型雙向凝膠電泳圖示例

圖2 差異點局部放大圖示例

2.2 質譜鑒定結果

對12個蛋白質點進行質譜分析，得到各個點的肽質量指紋譜，如圖3所示。運用Mascot軟件搜索Swissprot和NCBInr數據庫，共有11個點得到陽性鑒定，通過整合重復蛋白點后，確認為6個差異蛋白質點，其中，病例組與對照組相比，表達上調的點有3個：視黃醇結合蛋白4（Retinol－Binding Protein 4）、結合珠蛋白（Haptoglobin）、血清白蛋白（Serum Albumin），表達下調的點有1個：載脂蛋白 A1（Apolipoprotein A－I），在兩次實驗中表達不一致的點有2個，為避免實驗的假陽性，這2個點暫不予以考慮，如表1所示。

表1 6個差異蛋白質點

圖3 蛋白質點的MALDI－TOF－MS質譜結果示例

3 討 論

視黃醇結合蛋白4與心血管疾病的關系在國外研究中已有報道［4，5］，認為其血清水平的升高可能與動脈粥樣硬化的發生發展密切相關［6，7］，有研究發現冠心病患者的血清水平明顯高于健康者［8］；國內也有研究得出類似結果［9］。

結合珠蛋白是一種急性相蛋白［10］，在多種應激反應過程中，其血清表達明顯升高；在抗氧化反應、減少細胞損傷、炎癥反應中，結合珠蛋白也發揮重要作用［11］。

血清白蛋白是人體血清中含量最豐富的蛋白質，研究認為其濃度水平對冠心病的早期發現及預后具有一定的預測價值［12］。國外一項薈萃分析表明，低血清白蛋白組發生冠心病及冠心病的死亡風險均明顯高于高血清白蛋白組［13］，同時國內研究［14］發現，與對照組相比，血清白蛋白水平在急性心肌梗死患者組明顯降低，且與其臨床預后有很好的相關性。

載脂蛋白A1是高密度脂蛋白（HDL）的主要蛋白成分，能夠促進膽固醇的清除，并且在抗炎癥反應、抗氧化反應過程中發揮重要作用［15］，目前研究［16］表明，ApoA1能防止動脈粥樣硬化發生，對評價心血管疾病的危險程度、心肌梗死及其它心血管事件具有很好的預測價值。

既往對冠心病血瘀證的客觀化研究［17］發現，冠心病血瘀證與血液流變學、微循環障礙、血脂代謝障礙、血小板功能及抗凝－纖溶系統異常、血管內皮細胞損傷及免疫功能異常等過程相關。國內有研究在利用雙向電泳技術尋找與心絞痛血瘀證相關的蛋白時，發現了包括載脂蛋白A1、結合珠蛋白、血清白蛋白等在內的與血瘀證相關的差異蛋白質［18］，認為不穩定心絞痛血瘀證可能是一種炎癥反應，同時與脂代謝紊亂、凝血因子異常、心肌損傷等有關［19］。而在另一冠心病血瘀證的血漿蛋白質組學研究中［20］，發現了纖維蛋白原、免疫球蛋白、粒酶等與凝血、內皮損傷、免疫炎癥反應等相關的蛋白質，可以發展成為冠心病血瘀證的診斷標記物。

本文的研究結果表明，冠心病血瘀證相關的蛋白質主要集中于炎癥反應和脂質代謝方面，與文獻報道基本一致，同時也發現了像視黃醇結合蛋白4等具有深入研究意義的蛋白質，為進一步尋找冠心病血瘀證相關蛋白提供了線索。由于雙向凝膠電泳技術存在自身不足和局限性，本研究只得到了與冠心病血瘀證相關的部分蛋白質的信息，隨著技術的不斷創新和發展，實驗結果及其意義會得到進一步驗證和完善，其機制有待進一步探索。

1 陳灝珠.實用內科學［M］.第12版.北京：人民衛生出版社.2005：1 472～1 473.

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