果糖基肽氧化酶法測定糖尿病患者HbA1c

劉 俊 付 波

糖化血紅蛋白（HbA1c）含量可反映糖尿病（DM）患者過去2～3個月時間內平均血糖水平，如果能將其降至8.1%以下，DM并發癥的發生將會大大減少。因此，一種快速、簡便，準確性及精密度均符合臨床要求的HbA1c檢測方法對DM治療、預后均有重要意義。本文采用一種新的酶學方法——果糖基肽氧化酶法測定58例DM患者HbA1c濃度，并與陽離子交換高效液相層析法進行線性回歸對比分析，以及觀察其精密度和各種干擾因素的影響。

1 資料與方法

1.1 檢測對象

選取58例DM患者，其中男39例，女19例；年齡17～59歲，平均46.55歲；T1DM 15例，T2DM 43例，均符合1999年WHO和美國DM協會診斷標準［1］。

1.2 儀器與試劑

美國雅培AEROSET全自動生化分析儀，所用果糖基肽氧化酶法試劑、前處理液、校準品及質控品由日本第一化學公司提供；陽離子交換高效液相層析全自動HbA1c分析儀（HLC－723G7）及配套試劑由日本TOSOH公司提供。

1.3 檢測方法

采集58例DM 患者空腹靜脈血2ml，EDTAK2抗凝，同時用兩種方法檢測HbA1c含量。果糖基肽氧化酶法：標本經800g離心力離心5min，取紅細胞層25μl加入500μl前處理液中，放置5min后上機測定。其原理為：第一反應中，在蛋白酶的作用下切斷源于血紅蛋白A1c的β鏈N末端的糖化二肽，同時通過測定600nm與800nm的吸光度差，求出Hb的濃度；第二反應中，果糖基肽氧化酶作用于糖化二肽，在過氧化物酶存在下生成的過氧化氫與N－（羧甲基氨基羰基）－4，4’二甲胺基二苯胺化鈉（顯色劑）產生顯色反應。通過測定此吸光度求出HbA1c的濃度，根據求得的HbA1c濃度與Hb濃度計算出HbA1c（%）。陽離子交換高效液相層析法：直接檢測血液總Hb中的A1c（%）。

1.4 分析指標

（1）對兩種方法的測定結果進行線性回歸分析，以評價兩種檢測結果的相關性。（2）取HbA1c低、高值質控品各1份，采用果糖基肽氧化酶法同批檢測20次，評估批內精密度。（3）低、高值兩種質控物分別連續測定20天，計算批間精密度。（4）分別在樣本中加入不同濃度脂肪乳、葡萄糖和膽紅素，評價其對果糖基肽氧化酶法測定HbA1c結果的干擾情況。

2 結 果

2.1 兩種檢測方法的線性回歸分析

對兩種檢測方法的測值進行線性回歸，結果顯示兩者呈顯著正相關（r＝0.9637），線性方程Y＝0.9711X＋0.1607（Y為果糖基肽氧化酶法測定值，X為陽離子交換高效液相層析法測定值）。

2.2 果糖基肽氧化酶法的精密度

果糖基肽氧化酶法測定HbA1c低、高值質控品的批內變異系數分別是3.10%、3.50%，平均變異系數為3.30%；批間變異系數分別為4.20%、4.30%，平均批間變異系數4.25%。見表1。

表1 果糖基肽氧化酶法的精密度（%）

2.3 干擾試驗

將不同濃度膽紅素（100～500μmol／L）、脂肪乳（0.5～2.0%）、葡萄糖（2.0～10.0g／L）分別加入待測樣本中，采用果糖基肽氧化酶法測定加入干擾物前后的測定值偏差，結果顯示各種濃度膽紅素、脂肪乳、葡萄糖對測定結果無明顯干擾，偏差均＜0.30%。

3 討 論

HbA1c作為DM篩選、診斷、血糖控制、療效觀察的有效檢測指標在臨床中已廣泛應用。目前主要檢測方法有五種：陽離子交換高效液相層析法、微柱法、電泳法、親和層析法、免疫法，其中離子交換高效液相層析法是金標準方法，而免疫法是目前生化分析儀上常用的檢測方法。因為各種方法的原理不同，測定結果的準確度、重復性可能有所差異。本文采取DM患者血標本，應用果糖基肽氧化酶法和離子交換高效液相層析法測定，結果表明兩法相關性良好，r＝0.9637，批內和批間CV分別為3.30%、4.25%，符合試劑盒批內CV≤5%、批間CV≤10%的要求。同時也觀察了主要干擾因素膽紅素、脂肪乳、葡萄糖對檢測結果的影響，結果顯示三者加入標本中引起的偏差均小于0.30%，可以忽略不計。

值得注意的是，在采用果糖基肽氧化酶法測定DM患者HbA1c濃度時，（1）高速離心后，需正確采集血液細胞層，因為不同層面的血細胞HbA1c結果會有較大差別［2］，建議使用800g離心力離心5min，在血細胞層高度的20～80%范圍內采集標本；（2）同時應該避免標本溶血或保存時間過長；（3）所測標本的 Hb濃度高于160g／L或低于50g／L時，應調整前處理液的用量，以得到更準確的結果；（4）使用糖與氨基酸混合輸液患者，其標本測定結果可能出現假性增高。

1 葉任高，陸再英主編.內科學［M］.第6版.北京：人民衛生出版社，2004.787～795.

2 宮下瞮夫.日本臨床檢查自動化學會會志，2004，29：181.