硫化氫對阿爾茨海默病大鼠海馬信號分子一氧化氮和一氧化碳的影響

陳 濤 賈 佳 周發明 周少華※

H2S、NO和CO是機體產生的三種氣體信號分子，它們廣泛的組織分布和多樣的生物學效應近年來成了研究的一個熱點。研究顯示這三種氣體信號分子參與了腦缺血、認知功能障礙等神經系統疾病的病理生理過程［1～3］。目前這三種氣體信號分子已分別被報道與阿爾茨海默病(Alzheimer disease，AD)等認知功能障礙疾病有關。但AD中三種氣體信號分子間在是否存在相互影響尚未見報道。因此，本研究通過對AD大鼠腦室內給予外源性H2S，觀察大鼠海馬誘導型一氧化氮合酶(iNOS)/NO體系和血紅素氧合酶－1(hemeoxygenase－1，HO－1)/CO體系的變化，研究AD大鼠海馬氣體信號分子間的相互影響，為AD的病理生理機制研究提供實驗依據。

1.材料與方法

1.1 實驗分組與模型制備

1.1.1 分組 成年SD雄性大鼠24只(體重250～300g)，購自湖北醫藥學院實驗動物中心。經Morris水迷宮(購自中國醫學科學院)測試判定其空間辨別性學習記憶能力，剔除反應過于遲鈍或特別敏感的大鼠，將選出的24只大鼠隨機分為AD組、硫氫化鈉(NaHS)組，生理鹽水(NS)組，每組各8只。

1.1.2 模型制備與給藥 AD組、NaHS組雙側海馬區注射點(AP－3.5mm，ML±2.0mm，DV 2.7mm)分別注射 5μl(10μg)Aβ25～35，NS組則注射等量的生理鹽水。將8號注射針做成的套管置入右側腦室(AP－1mm，ML 1.5mm，DV 4mm)后固定好。NaHS組每日通過側腦室給予 NaHS 14 μmol/kg，其余兩組給予等量生理鹽水，連續7天。術后每天給予青霉素鈉2萬單位肌注防治感染。

1.1.3 標本制作 斷頭取腦后在冰面上迅速分離大鼠雙側海馬，冰生理鹽水中漂洗后用濾紙吸干，置入0.5ml trizol的EP管中保存在－80℃冰箱備用。

1.2 海馬組織中NO含量和iNOS活性的測定

1.2.1 NO含量測定:將凍存海馬組織取出按質量/體積(W/V)1/10加入預冷的生理鹽水，眼科剪剪碎后，用勻漿器制成10%組織勻漿，低溫低速離心機3000r/min，離心10分鐘，將離心好的勻漿上清用于測定組織中總蛋白含量、NO含量。按南京建成生物工程研究所生產的專用試劑盒參照說明書，先使用考馬斯亮蘭蛋白測定試劑盒測出海馬組織總蛋白含量，一氧化氮測試盒(硝酸還原酶法)在波長550nm處測吸光度值，依據公式計算出NO含量。

1.2.2 iNOS活性的測定:依據 NOS催化L－精氨酸和分子氧反應生成NO，而NO與親核性物質生成有色化合物的原理，應用南京建成生物工程研究所產一氧化氮合酶測定試劑盒檢測各組大鼠海馬組織勻漿上清中iNOS活性，結果以活力單位·毫克蛋白－1(U/mg·prot)表示。

1.3 海馬組織中CO含量和HO活性的測定

1.3.1 CO含量的測定:取新鮮制備的海馬勻漿上清0.5 ml，空白管中加入等量的蒸餾水，分別加入1 mg/ml的血紅蛋白1ml，混勻，室溫下反應10分鐘，以蒸餾水調零，測定測定管和空白管OD541和OD555，求得二者的比值(R值)，應用100%HbO2和100%HbCO不同比例混合繪制標準曲線，根據標準曲線計算HbCO%，CO(μmol/L)含量=［HbCO% ×Hb(mg/l)×40000］/［100×海馬組織(ml)×64456］。

1.3.2 HO活性的測定:取海馬組織勻漿0.5mg，加入膽綠素還原酶4mg、還原型輔酶Ⅱ(NADPH終濃度0.8 mol/L)、6－磷酸葡萄糖(終濃度4mmol/L)、6－磷酸葡萄糖脫氫酶(1U)、血紅素(終濃度20 mol/L)，加入pH 7.4磷酸鉀緩沖液至1ml，充分混勻，于37℃水浴，避光反應20分鐘，冰浴終止反應。然后用分光光度計測定波長463 nm和530nm的吸光度差值，膽紅素消光系數為40/mmol/(L·Cm)，HO活性用生成的膽紅素μmol/(g·h)來表示。

2.結果

如表1結果所示，同NS組相比，AD組和NaHS組海馬組織中NO、CO含量均升高，iNOS、HO－1活性均增加，差異有統計學意義(P＜0.05或P＜0.01)。同AD組同相比，NaHS組海馬組織NO含量顯著減少，iNOS活性明顯降低，而CO含量增加，HO－1活性明顯增強，差異具有顯著性(P＜0.05或P＜0.01)。

表1 三組大鼠海馬NO、CO含量及iNOS、HO－1活性(±s)

表1 三組大鼠海馬NO、CO含量及iNOS、HO－1活性(±s)

注:*P＜0.05 ＊＊P＜0.01 vs NS #P＜0.05 ##P＜0.01vsAD。

項 目 N NS組 AD組 NaHS組NO(μmol/L) 8 0.49±0.03 1.19±0.57＊＊0.57±0.07*##CO(umol/L) 8 0.22±0.03#0.31±0.04*0.39±0.06*#iNOS(U/mg pro) 8 0.28±0.07 0.71±0.39＊＊0.39±0.14*##HO－1(U/mg pro) 8 1.89±0.37 2.63±0.45*3.65±8.46＊＊##

3.討 論

NO和CO是可溶性鳥苷酸環化酶的激活劑，能夠影響中樞和外周神經系統，發揮著神經調節因子的作用，并且這兩種氣體分子參與了AD等神經系統疾病的病理生理過程，與認知、行為相關。H2S作為一種新型的氣體信號分子，體內2/3的H2S則以NaHS形式存在，也參與了AD的病理過程［4，5］。

NO作為一種神經遞質在中樞神經系統中發揮著雙重作用，一方面NO對維持正常生理功能的神經保護作用，又在一定條件下又具有神經毒性作用。NOS是其合成的重要限速酶，NO依賴于NOS的活性，由NOS催化L－精氨酸而成。iN0S為非Ca2+依賴型，在正常生理情況下無活性表達，病理狀態下被激活，產生大量NO，導致細胞毒性作用。而Aβ蛋白的沉積可以引起大鼠海馬中的NO生成增多，引起認知功能障礙。Aβ誘導的NO/iNOS途徑被認為是其在AD的一個重要神經毒性機制［5］。在本研究中，我們也觀察到給予Aβ25～35后，大鼠海馬iN0S活性增高，NO含量增加。而給予NaHS組大鼠海馬的iNOS活性明顯降低，NO含量顯著減少。表明外源性H2S對iNOS/NO體系具有抑制作用，這可能是H2S在AD中神經神經保護的一個可能的機制。

CO也是體內通過激活cGMP而發揮第二信使的作用的一個重要的氣體信號分子。內源性CO來源于血紅素的降解，而HO是血紅素代謝過程中的限速酶，HO的催化產物鐵離子、一氧化碳和膽綠素/膽紅素都是在調節機體氧化還原平衡中發揮著重要的作用。HO－l廣泛存在于全身多種組織，氧化應激刺激能誘導其表達。而氧化應激反應是AD發病的一個非常重要的機制，HO－1在AD發病過程中起到重要的作用［7，8，9］。此外，HO －1 的高表達還可以減低神經細胞中磷酸化Tau蛋白的表達，這也是其神經保護作用的一個重要機制［10］。研究顯示，H2S作為軸配體的輔基能與血紅素蛋白結合，發揮著HO活性調節作用，H2S還可通過上調GABAB受體的表達及 CO 體系，減輕神經損傷［11，12，13］。在本研究中，AD組大鼠海馬的HO－1/CO體系上調，對Aβ毒性損傷發揮保護作用，而給予NaHS后大鼠海馬的HO－1/CO體系上調更加顯著。

許多研究表明，NO、CO和H2S三種氣體信號分子在生成的代謝途徑、轉運、作用靶點、信號轉導通路及生物學效應上存在復雜的相互作用。在LPS刺激的小鼠巨噬細胞炎癥反應的實驗研究中，已經發現H2S可以激活巨噬細胞中HO－1/CO體系表達，而該激活作用介導了H2S對iNOS/NO的抑制效應［14］。盡管三種氣體信號分子具體作用機制尚未明確，但目前認為cGMP、KATP通道、鈣通道、NF－κB信號通路、MAPK信號通路可能參與了三種氣體信號分子的生物學效應，它們都有可能是氣體信號網絡發揮效應的重要交叉點［15］。

綜上可知，外源性H2S能抑制Aβ25～35誘導AD大鼠海馬iNOS活性，降低NO含量，激活HO－1活性，增加CO含量。外源性H2S對iNOS/NO體系抑制作用，對HO－1/CO體系的激活可能是其在阿爾茨海默病中發揮神經保護作用的一個重要途徑。NO、CO和H2S三種氣體信號分子在AD病理生理中相互作用的具體機制值得進一步研究。

1 聶永慧，王魯寧，葉玲，等.β淀粉拌蛋白1－42對小膠質細胞產生一氧化氮作用的實驗研究［J］.軍醫進修學院學報，2005，26(6):461－463.

2 Zhang Q，Du J，Zhang W.Impact of hydrogen sulfide on carbon monoxide/heme oxygenase pathway in t he pathogenesisof hypoxic pulmonary hypertension［J］.Biochem Biophys Res Commun，2004，317:30 －37.

3 Malinski T.Nitric oxide and nitroxidative stress in Alzheimer’s disease［J］.Journal of Alzheimer’s disease，2007，11:207－218.

4 陳秀琴，唐小卿，李景田，等.硫化氫對β2淀粉樣蛋白誘導PC12細胞凋亡的影響［J］. 解剖學研究，2007，29:107－110.

5 Kimura Y.Hydrogen sulfide protect s neurons from oxidative stress［J］．FASEB J，2004，18:1165 －1167.

6 De la Torre JC，Pappas BA，Prevot V，etal.Hippocampal nitric oxide upregulation precedes memory loss and A beta1－40 accumulation after chronic brain hypoperfusion in rats［J］.Neurol Res，2003，25(6):635－641.

7 Schipper HM.Hemeoxygenase expression in human central nervous system disorders［J］.Free Radic Biol Med，2004，37:1995 －2011.

8 Calabrese V，Sultana R，Scapagnini G，etal.Nitrosative stress，cellular stress response，and thiol homeostasis in patients with Alzheimer's disease［J］.Antioxid Redox Signal，2006，8:1975 －1986.

9 Infante J，Rodríguez-Rodríguez E，Mateo I，etal.Gene-gene interaction between hemeoxygenase-1 and liver X receptor-beta and Alzheimer's disease risk. ［J］.Neurobiol Aging.2010 Apr;31(4):710－714.

10 Vaya J，Song W，Khatib S，etal.Effects of hemeoxygenase－1 expression on sterol homeostasis in rat astroglia ［J］.Free Radic Biol Med，2007，42:864－871.

11 Kashiba M，Kajimura M，Goda N，etal．From O2 to H2S:a landscape view of gas biology［J］．Keio J Med，2002，51(1):1 －10.

12 Han Y，Qin J，Chang X，Yang Z，Du J.Hydrogen sulfide and carbon monoxide are in synergy with each other in the pathogenesis of recurrent febrile seizures［J］.Cell Mol Neurobiol，2006，26(1):101 －107.

13 Han Y，Qin J，Chang X，Yang Z，Bu D，Du J.Modulating effect of hydrogen sulfide on gamma-aminobutyric acid B receptor in recurrent febrile seizures in rats［J］.Neurosci Res，2005，53(2):216－219.

14 Oh GS，Pae HO，Lee BS，etal.Hydrogen sulfide inhibits nitric oxide production and nuclear factor-kappa B via hemeoxygenase-1 expression in RAW264.7 macrophages stimulated with lipopolysaccharide［J］.Free Radic Biol Med，2006，41(1):106 －119.

15 金紅芳，杜軍保，唐朝樞.“廢氣不廢”:氣體信號分子硫化氫的研究進展［J］. 生理學報，2010，62(6):495－504