TACE治療對兔VX2腎移植瘤細胞增殖影響的實驗研究

劉 峰 ，柳 港 ，王 帥 ，王 濱 ，蹇兆成 ，孫業全

（1.濰坊醫學院，山東 濰坊 261053；2.濰坊醫學院附屬醫院，山東 濰坊 261053）

腎癌是最常見的腎實質惡性腫瘤，約占成人惡性腫瘤的2%～3%，各國或各地區的發病率不同，發達國家發病率高于發展中國家[1]。盡管根治性手術切除為其主要治療方法，但仍有40%的腎癌確診時已有遠處轉移，手術機會率低。目前，隨著介入技術的廣泛開展，經導管腎動脈化療栓塞術作為腎癌根治術前及中晚期腎癌治療的輔助措施，已廣泛應用于臨床，療效顯著，可減少術中出血及術中可能引起的腫瘤擴散，使腫瘤縮小，緩解癥狀，延緩病情發展[2]，提高手術切除率。本研究對兔VX2腎移植瘤模型進行TACE治療，栓塞后7 d處死動物取出瘤塊，免疫組化染色檢測腫瘤細胞增生核抗原（Proliferating cell nuclear antigen,PCNA）的表達。為臨床TACE治療腎癌的療效評價提供了分子水平的切實有效的理論依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

新西蘭大白兔22只，雄性，體質量2.5～3.0 kg，由山東省農業技術科學院動物實驗中心提供（許可證號：sxk-魯-2009-0013）。

1.2 VX2瘤細胞株

瘤細胞傳代兔由協和醫科大學基礎醫學院提供（許可證號：scxk-京-2009-0014）。

1.3 實驗藥品及器材

3%戊巴比妥鈉，阿霉素，70%復方泛影葡胺，碘化油；1.5T磁共振，介入導管機。

1.4 動物模型建立

采用開腹直視下瘤塊埋植法建立兔腎腫瘤動物模型。建模2周后經超聲檢查，將適合介入治療的動物隨機分為實驗組和對照組。

1.5 介入操作

將實驗動物隨機分為兩組，對照組10只，實驗組12只。DSA監視下，經股動脈穿刺插管至腎動脈，造影明確導管在靶血管后，實驗組：2 mg/kg阿霉素、0.2 mL/kg超液態碘油充分混勻后經微導管緩慢注入，栓塞腫瘤；對照組：經導管注入10 mL生理鹽水（圖1）。

1.6 取材及免疫組織化學染色

腫瘤治療后7 d耳緣靜脈空氣栓塞處死動物，留取腫瘤標本（周邊包含少許正常的肝組織），沿軸位最大徑將瘤塊一分為二用10%福爾馬林固定，包埋蠟塊時即以此最大徑為切面，若瘤塊過大則在此最大徑切面上分別取瘤塊中心和周邊的組織（或中心壞死灶周圍和瘤塊周邊的組織）進行包埋，5 μm連續切片，進行免疫組化染色（PCNA，北京中杉，PV9002法，抗體濃度1∶80）。陽性標準為陽性細胞染色為黃色或棕黃色，定位于細胞核內；在高倍鏡下（×400）隨機抽取腫瘤非壞死區域計數5個高倍視野各200個細胞，分別記數陽性細胞，按公式：PCNA陽性細胞增殖指數（Proliferation index,PI）=PCNA陽性細胞數/腫瘤細胞數，計算PI[3]。

1.7 統計學處理

數據采用統計學軟件SPSS 11.5進行統計學處理，P<0.05時差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 PCNA的表達情況

PCNA陽性染色表現為細胞核有棕黃色顆粒。對照組PCNA染色陽性細胞彌漫分布或片狀分布，且周邊比腫瘤中心表達略強，癌旁組織散在表達，但表達較弱（圖2）；TACE組腫瘤中心部分壞死，部分標本腫瘤壞死部分內散在的表達，但腫瘤周邊部分細胞增殖核抗原表達增強，細胞核增大深染（圖3）。

2.2 PCNA的量化數據及統計分析

將通過計數得出的PI值較后得出：對照組（61.2±11.21）%與 TACE 組（71.6±11.01）%之間具有顯著差異性（P=0.041）（表1），即對照組中 PCNA 的表達強度低于TACE組。

3 討論

PCNA亦稱周期素，是聚積在S期細胞核內復制的細胞周期依賴性蛋白，是DNA多聚酶δ的輔助蛋白，與細胞周期緊密相關，PCNA在G1期開始增加，S期達到高峰，G2期下降，M期降至最低，且與患者預后有關[4]。作為一個內源性增殖細胞的標記物，PCNA與癌組織的增殖活性、轉移及預后關系密切。

表1 PI在各組中的分布情況（）

表1 PI在各組中的分布情況（）

注：1：與對照組比較，P<0.05。

組別 例數 PI（%） t值 P值對照組 10 61.2±11.21 TACE 組 12 71.6±11.011 2.184 0.0411

3.1 腫瘤細胞增殖活性的檢測

PCNA對DNA復制的調節起重要作用，PCNA的合成與表達與細胞增殖密切相關，是反映細胞增殖的主要生物學指標，并調控細胞周期。免疫組化染色的顯色系統是將二抗和酶通過一個多聚糖骨架聯接成一個多聚體，直接放大信號一倍，是目前公認的一種有效、敏感地進行細胞增殖的定量檢測方法。

免疫組化研究表明，PCNA在細胞核中有兩種形式：一種是可溶性，可溶于乙醇等有機溶劑而被洗脫，經過處理的組織和細胞中可以消失，在細胞周期中，它的量不發生變化；另一種是不溶性，不溶于有機溶劑，是復制所必需的，它的出現明顯與細胞增殖有關。因為參與細胞周期循環、復制和修復，所以凡進入增殖周期的細胞在凋亡檢測中均為陽性反應。故可有效地根據陽性細胞的多少反映腫瘤細胞的PI[5-6]，進而反映細胞增殖狀況。細胞PI越高，反映細胞的周期越短，并且其在各種腫瘤中均能穩定地表達，在大部分正常組織中不表達或僅有十分微弱的表達。理論上，腫瘤的分化程度與腫瘤的預后是密切相關的，而這種周期性變化恰好與細胞增殖過程相似[7-8]。因此，細胞PI被認為是反映細胞分裂程度、衡量細胞增殖進程的相同步的客觀評估指標，不僅能反映腫瘤細胞的增殖活性，同時也與腫瘤細胞的分化程度及患者預后有關。在腫瘤理論的研究中，一般認為腫瘤分化越低，增殖力越強，惡性程度越高，其過度表達越強[9]。本研究參考文獻應用免疫組化染色（PV9002法）檢測PCNA的表達取得了理想的實驗結果。

3.2 TACE治療后兔VX2肝移植瘤組織中PCNA的表達

在我們的實驗免疫組化結果顯示2組共22只實驗動物中PCNA均有表達，陽性率為100%，TACE組（71.6±11.01）%PI明顯高于對照組（61.2±11.21）%（表1），與Huang等[10]報道肝癌經 TACE治療后殘留癌的PCNA標記指數增高的觀點一致。經TACE治療后殘留癌的PCNA標記指數增高，其原因可能與以下幾方面有關：①腎移植瘤經TACE治療后可發生程度不等的腫瘤壞死，在腫瘤邊緣或多或少地存在殘留癌，殘留癌中新生腫瘤細胞所占比例增大；這個部位的腫瘤生長最活躍，使G0期的細胞進入細胞分裂周期中，處于S期的癌細胞增加，即相應地PCNA表達量也增加[4]。②栓塞后新生血管的形成，側支循壞的建立，這主要是由于TACE治療后腫瘤缺氧、壞死，缺氧與壞死組織又可刺激血管內皮生長因子（VEGF）等的分泌[11]，VEGF與其特異性受體結合后，受體首先自磷酸化，繼而激活磷脂酞膽堿特異性磷脂酶 C（PLCy）、水解磷脂酞肌醇二磷酸（PIP2），產生二脂酞甘油（DAG）和肌醇三磷酸（IP3），其中DAG可激活胞漿中蛋白激酶C（PKC）并固定于膜上，然后誘導內皮細胞生長，參與細胞外蛋白水解和基底膜的降解，利于血管內皮細胞的遷移和增生，促進了血管形成。③VEGF又叫血管滲透因子，它不但可以促進腫瘤新生血管的形成還可增加血管的通透性。VEGF通過一種小泡囊狀細胞器（VVO）引起內皮細胞窗開放并維持這種狀態，從而導致微血管特別是毛細血管后靜脈和小靜脈的滲透性增加。其增加微血管通透性的能力是組織胺的5萬倍，VVO由許多小囊和空泡相互連接成葡萄樣結構，從管腔膜一直延伸到基底膜，并與窗隔相連，當窗開放時，生物大分子即可通過基底膜漏出，引起腫瘤血管中的血漿蛋白、纖維蛋白和其他循環大分子的外滲，形成富含纖維的細胞外基質，這種臨時基質支持成纖維細胞和內皮細胞的內生，成纖維細胞和內皮細胞又可將臨時基質轉化為成熟的腫瘤基質，從而為腫瘤細胞生長創造了物質條件。Mei等[12]也報道VEGF的表達與腫瘤瘤細胞的增殖和凋亡有關。

兔VX2腎移植瘤成功率比較高，選擇合適的治療時機和治療方案進行介入治療，能夠取得理想的療效，是一個研究腎癌介入治療的理想的動物模型，實驗組術后腫瘤大部分發生壞死。本實驗采用免疫組化法檢測腫瘤PCNA的表達，發現TACE術后殘余的腎癌組織細胞PI升高。

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