磁共振彌散成像活體檢測rAd/p53治療人類結腸癌荷瘤裸鼠早期療效

謝 琦 ，張鼎旋 ，梁碧玲 ，陳明旺 ，張 靜 ，吳延恒

（1.廣州醫學院附屬廣州市第一人民醫院/廣州市南沙中心醫院醫學影像科，廣東 廣州 510240；2.中山大學第二附屬醫院放射科，廣東 廣州 510120；3.廣州醫學院附屬廣州市第一人民醫院，廣東 廣州 510180；4.暨南大學第一臨床醫學院影像科，廣東 廣州 510635）

rAd/p53治療效果的活體評價目前局限于用影像方法觀察腫瘤大小的改變[1-3]。而rAd/p53治療的有效性最早體現在p53能進入腫瘤細胞內并成功轉錄、表達、引起腫瘤內部細胞凋亡、壞死[1-2]，而腫瘤大小改變出現較晚。MR擴散加權成像（DWI）在判斷腫瘤細胞的生物學特性與壞死方面具有很大潛力[4-8]，本研究擬運用磁共振DWI觀察rAd/p53治療結腸癌荷瘤鼠的早期改變，探索DWI活體無創評價rAd/p53早期抗癌療效的標記物。

1 材料和方法

1.1 動物模型制作

BALB/c裸鼠購自中山大學動物實驗部，19～23 g體質量，鼠齡4～6周，雌雄不限，養殖于中山大學動物實驗部SPF級實驗室。人類結腸癌SW480細胞株（p53突變型）購自中國科學院上海細胞庫。常規細胞培養，取對數生長期細胞制成濃度為1×107mL-1的細胞懸液。

將上述SW480細胞懸液分別注射至5只裸鼠脅部皮下（0.5mL/只）。15d后腫瘤生長至1.5～1.8cm，小鼠在麻醉狀態下（4.5%水合氯醛2 mL/100 g腹腔注射）切取腫瘤塊并切成約2 mm3小塊作為移植瘤材，并種植于52只外表健康裸鼠皮下。

上述荷瘤鼠于種瘤后42 d，活體測量腫瘤大小并計算腫瘤體積（V=π/6×長×寬×高）[9]，按腫瘤大小隨機均勻分成2組：對照組，給予生理鹽水；rAd/p53（深圳賽百諾生物科技公司）治療組，1×107VIP的rAd/p53/mm3腫瘤，每組25只。給藥途徑為直接瘤內注射。

1.2 療效檢測

1.2.1 MR檢查

上述荷瘤鼠治療后分籠飼養，于假治療或治療后 24 h、48 h、72 h、120 h、168 h 各組分別隨機取 5個腫瘤量荷瘤鼠，同上方法麻醉荷瘤鼠，用Philips Gyroscan Intera Achieva 1.5T Ivova Dual HP超導型MR成像儀、膝關節8通道相控陣線圈（Synkeen-8）行以下序列成像。

T2WI快速自旋回波（TSE）：TR/TE=2600ms/100ms，SENSE加速因子=2，行軸位、冠狀、矢狀位成像，成像時間=65 s。采集矩陣=172×135，重建矩陣=224×224，層厚=2 mm，間隔=0，FOV=120 mm。

DWI[9]：采用單次激發平面回波成像序列（EPI），橫軸位成像，TR=639～1 220 ms，TE＝43～49 ms， 隨 b值相應調整，按各向同性施加擴散敏感梯度場，b=800 s/mm2， 采集時間 28.5 s，FOV=120 mm，NAS=6，層厚 2 mm，間隔=0，采集矩陣＝64×62，重建矩陣＝96×96。

1.2.2 標本的實驗檢測

荷瘤鼠完成上述檢查后，腹腔注射常規麻醉量5倍的水合氯醛處死，完整取出腫瘤，將腫瘤以成像軸位最大徑線處對半切開，一半即凍于-30°C冰箱用于western blot，另一半用4%BPS緩沖福爾馬林固定液固定，石蠟包埋，連續切片，TUNNEL法檢測細胞凋亡（細胞凋亡原位檢測試劑盒，南京凱基生物科技發展有限公司）。

2.2 兩組患者出院后發生不良反應情況 對照組患者出院1個月后大便出血1例，牙齦出血1例;3個月后大便出血2例，皮膚黏膜出血2例，下肢血栓栓塞2例;6個月后大便出血2例，牙齦出血2例，胃出血1例;下肢血栓栓塞2例。實驗組出院6個月后牙齦出血1例。兩組患者出院3、6個月發生不良反應情況比較差異有統計學意義(P＜0.05)。

western blot檢測：從-30℃的冰凍組織提取細胞液，抗原抗體免疫反應的一抗為1∶2 000濃度免抗p53抗體（Santa Crag Bictech公司）或鼠抗β-actin抗體（Baster公司），二抗為1∶3 000濃度抗兔IgGHRP或1∶4 000濃度抗鼠IgG-HRP（Cell Signaling technology公司）。

1.3 結果判定

ADC值與EADC值的測量：DWI采集的數據用磁共振成像儀自帶的分析軟件擬合出ADC圖和EADC圖，在腫瘤最大切面利用感興趣區（ROI）自動測量并計算出ADC值、EADC值。ROI在腫瘤中央區域覆蓋高信號區（ADC圖），或低等信號區（EADC圖），測量腫瘤中央的ADC值與EADC值；在上述區域四周各取4個ROI，測量周圍的ADC值和EADC值，取4個值的均值為腫瘤周邊的ADC值與EADC值。ROI面積為8.7～69.5 mm2。

病理切片由兩位有經驗的病理科醫師分別按同一標準在光學顯微鏡下閱片分析，取兩者采集的均數值為病理檢測結果。TUNNEL檢測陽性細胞為細胞核呈棕黃色。在100倍視野下觀察并估算切片內TUNNEL染色陽性細胞與形態為死亡細胞的腫瘤細胞面積的百分比為腫瘤凋亡范圍。

western blot p53蛋白表達圖像分析：最終膠體的顯影結果經掃描儀掃入電腦以JPG格式保存，用Imagepro-plus 6.0版自動圖像分析系統處理自動計算每組樣本每個條帶光密度（IOD）。

1.4 統計學處理

所得數據輸入SPSS 13.0軟件中建立數據庫計算分析，整體樣本檢驗采用秩和檢驗，兩兩比較采用Wilcoxon檢驗，相關性分析采用spearman相關檢驗，將P<0.05設為差異有統計學意義。

2 結果

rAd/p53治療后24 h即可見腫瘤中央出現ADC圖上的高信號、EADC上為低信號區域或相應區域范圍擴大（圖1）。

2.1 腫瘤ADC值與EADC值改變

2.1.1 腫瘤中部

EADC值：rAd/p53治療后不同時間點，腫瘤中部的EADC值較對照組降低。各時間點W統計量與P值依時間遞增分別為：15，0.008；15，0.008；15，0.008；15，0.008；15，0.008（圖3）。

2.1.2 腫瘤邊緣

ADC值：rAd/p53治療后不同時間點，腫瘤邊緣部的ADC值多較對照組增加。各時間點W統計量與P值依時間遞增分別為：10，0.008；27，1.000；15，0.008；15，0.008；15，0.008（圖4）。

EADC值rAd/p53治療后不同時間點，腫瘤邊緣的EADC值較對照組降低。各時間點W統計量與P值依時間遞增分別為20，0.151；15，0.008；15，0.008；15，0.008；15，0.008（圖 5）。

2.2 實驗評價

2.2.1 TUNNEL

圖1 單純rAd/p53治療后腫瘤在T2WI、ADC圖、EADC圖的改變。對照組（圖1a），治療后24 h（圖1b）。Figure 1.Tumor on T2WI,ADC and EADC images.Control group(Figure 1a).24 h after rAd/p53 adminstration(Figure 1b).

圖2 rAd/p53治療后不同時間點腫瘤中部ADC值變化圖。Figure 2. ADC value in the center of tumor after rAd/p53 injection.

圖3 rAd/p53治療后不同時間點腫瘤中部EADC值變化圖。Figure 3. EADC value in the center of tumor after rAd/p53 injection.

圖4 rAd/p53治療后不同時間點腫瘤邊緣ADC值變化圖。Figure 4. ADC value at the periphery of tumor after rAd/p53 injection.

圖5 rAd/p53治療后不同時間點腫瘤邊緣EADC值變化圖。Figure 5. EADC value at the periphery of tumor after rAd/p53 injection.

rAd/p53治療后不同時間點，腫瘤內細胞凋亡較對照組增加，見表1（Wilcoxon 檢驗，P≤0.016）。

2.2.2 p53 表達（western blot）結果見表2，圖6。

p53蛋白表達：rAd/p53治療24 h可見增加，120 h達峰值；基因+碘油治療，24 h即增加，48 h達峰值，治療后不同時間點，腫瘤p53蛋白表達較對照組增加（Wilcoxon 檢驗，P≤0.016）。

表1 不同配伍治療腫瘤細胞凋亡（TUNNEL）情況的比較（）

表1 不同配伍治療腫瘤細胞凋亡（TUNNEL）情況的比較（）

組別 24 h 48 h 72 h 120 h 168 h對照組 0.323±0.060 8 0.353±0.033 0 0.347±0.051 2 0.323±0.054 2 0.403±0.053 6 p53 治療組 0.515±0.172 2 0.545±0.055 8 0.531±0.048 2 0.648±0.120 8 0.578±0.073 2

表2 不同配伍治療腫瘤治療組與對照組p53表達光密度情況的比較（）

表2 不同配伍治療腫瘤治療組與對照組p53表達光密度情況的比較（）

組別 24 h 48 h 72 h 120 h 168 h對照組 192.38±73.79 192.38±73.79 192.38±73.79 192.38±73.79 192.38±73.79 p53 治療組 404.86±133.86 396.99±159.84 1 262.12±218.95 1 283.35±194.23 991.77±108.17

圖6 rAd/p53與對照組在不同時間點腫瘤細胞p53表達western blot檢測。圖6a分別為對照組，治療 24 h，48 h，72 h，120 h 和 168 h。圖6b 為 β-actin。Figure 6.Western blot analysis of p53 expression of tumor at different time point after rAd/p53 injection.

2.3 不同評價方法的相關性分析（spearman相關分析）

p53表達光密度與腫瘤凋亡范圍呈明顯正相關（γ、P：0.667 8，0.000 0）。ADC 值與腫瘤細胞凋亡范圍呈正相關（γ、P：0.205 3，0.000 0）， 與腫瘤 p53 表達光密度呈正相關（γ、P：0.2038，0.0000）。EADC 值與腫瘤細胞凋亡范圍呈負相關（γ、P：-0.3184，0.0000），與腫瘤 p53表達光密度呈負相關（γ、P：-0.328 0，0.0000）。

3 討論

p53已作為替換突變與失活的腫瘤抑制基因以達到治療腫瘤目的的經典候選基因。在p53治療腫瘤的實驗與臨床研究可見，有效的治療可出現外源性野生型p53蛋白的高表達，促進腫瘤細胞滯于G1期，通過多條生物途徑引起腫瘤細胞凋亡增加[1-2，10-11]。因此，p53蛋白是外源性野生型p53治療腫瘤的早期抗癌效果的分子標志物。本研究結果也顯示，rAd/p53治療結腸癌荷瘤裸鼠，腫瘤細胞的凋亡與p53蛋白的表達呈正相關。

但p53要發揮調節細胞周期、促進腫瘤凋亡的作用，需要其下游有完整的信號轉導通路，凋亡前基因bax等的功能正常并被激活[12]。有研究表明，對帶bax突變的LS174T結腸癌細胞株在p53過表達的情況下，腫瘤細胞凋亡仍受抑制[13]。可見，與其它抗癌藥物一樣，rAd/p53的抗癌作用也存在腫瘤細胞“耐藥”現象。因此，在分子水平及時活體評價p53對腫瘤細胞抗癌效果非常重要。

一般公認DWI是以水分子彌散特點為基礎的成像技術，活體的DWI上，組織水分子的擴散系數值受到許多因素的影響，如體液的流動、細胞的滲透性和溫度、毛細血管灌注、細胞內外水的黏滯度、比例、膜通透性的方向等[14]，因此，DWI能反映組織的生物學特點，可提供組織生物物理特性的信息，如細胞的組織結構、微結構和微循環[15]。在實際工作中常用表觀擴散系數（ADC）值來代替真正的擴散系數，指數ADC即EADC用于顯示組織的彌散權重效果。如腫瘤細胞膜完整，細胞密實，彌散受限，彌散相對較慢，彌散曲線衰減較慢，ADC值較低[14]；腫瘤細胞壞死，細胞膜不完整，細胞稀疏，細胞間間隙擴大，彌散曲線衰減迅速，ADC值大，在高b值的DWI圖像上組織信號降低[14-15]。所以，高b值的DW-MRI能更敏感顯示腫瘤組織的組織病理特征[9，14-15]。

在臨床與臨床前期的研究結果提示DWI可作為反映治療效果的可靠指針[4-8]。對C26結腸癌荷瘤鼠模型經阿霉素化療或氨基酮戊酸基的光動力治療，前者在治療后24～48 h、后者在治療后6～24 h腫瘤的彌散指數有意義增加[4]。對大鼠皮下橫紋肌肉瘤移植模型給予血管靶性治療藥（Combretastatin）的研究[5]，用藥后1 h和6 h，ADC值降低，組織病理顯示腫瘤血管充血或閉塞，無腫瘤壞死，2 d后ADC升高，組織學檢查見腫瘤進行性壞死，9 d后ADC值降低與腫瘤再生有關，認為測量ADC值可能區分無灌注而又存活的細胞與無存活的壞死腫瘤組織。在對人類膠質瘤荷瘤鼠模型經5-FU聯合TRAIL/APO2L治療后2 d、3 d可見腫瘤ADC值有意義增加，并與腫瘤細胞的凋亡增加相關[6]。人類膠質瘤荷瘤鼠模型腫瘤內注射化療藥BCNU后24 h可見ADC值有意義增加，并與隨后的腫瘤縮小有相關性[7]。臨床研究提示[8]，對于結腸癌肝轉移瘤的患者全程化療后3周行DWI，對化療有效的病灶ADC值有意義的增加。上述的一系列研究結果表明DWI可在腫瘤大小發生改變前，及時監測抗癌藥對腫瘤細胞的療效，在早期評價抗癌藥物對腫瘤細胞的抗癌效果是一很有潛力的工具。

關于rAd/p53治療腫瘤療效評價的實驗與臨床研究，均采用觀察腫瘤大小改變、組織病理改變與臨床觀察[1-3]，目前未見rAd/p53治療腫瘤后用DWI評價其療效的實驗與臨床研究。本研究結果可見，治療后5個觀察時間點可見腫瘤中央與邊緣的ADC值大多增加，EADC值降低。ADC值與TUNNEL及western blot提示的腫瘤凋亡增加，p53表達增加呈正相關，EADC值呈負相關。腫瘤中央壞死區域ADC值高于周邊區域，EADC值低于周邊區域，但治療組周邊區域ADC值較對照組明顯升高，EADC值明顯降低，組織病理可見完整腫瘤細胞，提示rAd/p53可能通過滲透至周邊區域，引起腫瘤細胞膜內外水分子擴散改變。

總之，DWI的ADC圖、EADC圖及相應的ADC值和EADC值可在治療后24 h即可出現有統計意義的改變，可作為單純rAd/p53或聯合化療治療腫瘤早期療效活體評價的生物標記物。

[1]Roth JA.Adenovirus p53 gene therapy[J].Expert Opin Biol Ther,2006,6(1):55-61.

[2]Guan YS,La Z,Yang L,et al.p53 gene in treatment of hepatic carcinoma:status quo[J].World J Gastroenterol,2007,13(7):985-992.

[3]Sze DY,Freeman SM,Slonim SM,et al.Becker Young Investigator Award:Intraarterial Adenovirus for metastatic gastrointestinal cancer:activity,Radiographic response,and survical[J].J Vasc Interv Radiol,2003,14(3):279-290.

[4]Roth Y,Tichler T,Kostenich G,et al.High-b-value diffusionweighted MR imaging for pretreatment prediction and early monitoring of tumor response to therapy in mice[J].Radiology,2004,232(3):685-692.

[5]Thoeny HC,Keyzer FD,Chen F,et al.Diffusion-weighted MR Imaging in Monitoring the Effect of a Vascular Targeting Agent on Rhabdomyosarcoma in Rats[J].Radiology,2005,234(3):756-764.

[6]Lee KC,Hamstra DA,Bhojani MS,et al.Noninvasive Molecular Imaging Sheds Light on the Synergy between 5-Fluorouracil and TRAIL/Apo2L for Cancer Therapy[J].Clin Cancer Res,2007,13(6):1839-1846.

[7]Hall DE,Moffat BA,Stojanovska J,et al.Therapeutic efficacy of DTI-015 using diffusion magnetic resonance imaging as an early surrogate marker[J].Clin Cancer Res,2004,10(23):7852-7859.

[8]Koh DM,Scurr E,Collins D,et al.Predicting response of colorectal hepatic metastasis:value of pretreatment apparent diffusion coefficients[J].AJR,2007,188(4):1001-1008.

[9]謝琦，梁碧玲，張靜，等.臨床醫用1.5T MR成像儀對人類結腸癌裸鼠移植瘤模型的DWI研究[J].中國醫學影像技術，2009，25（增刊）：15-18.

[10]Yazlovitskaya EM,DeHaan RD,Persons DL.Prolonged wildtype p53 protein accumulation and cisplatin resistance[J].Biochem Biophys Res Commun,2001,283(4):732-737.

[11]Yu ZW,Zhao P,Liu M,et al.Reversal of 5-flouroucial resistance by adenovirus-mediated transfer of wild-type p53 gene in multidrug-resistant human colon carcinoma LoVo/5-FU cells[J].World J Gastroenterol,2004,10(13):1979-1983.

[12]Miyashita T,Reed JC.Tumor suppressor p53 is a direct transcriptional activator of the human bax gene[J].Cell,1995,80(2):293-299.

[13]Tamm I,Schumacher A,Karawajew L,et al.Adenovirus-mediated gene transfer of P16INK/CDKN2 into bax-negative colon cancer cells induces apoptosis and tumor regression in vivo[J].Cancer Gene Ther,2002,9（8）:641-650.

[14]Lyng H,Haraldseth O,Rofstad EK,et al.Measurement of cell density and necrotic fraction in human melanoma xenografts by diffusion weighted magnetic resonance imaging[J].Magn Reson Med,2000,43(6):828-836.

[15]Ichikawa T,Erturk SM,Motosugi U,et al.High-B-value diffusion-weighted MRI in colorectal cancer[J].AJR,2006,187(1):181-184.