重癥監護病房耐甲氧西林金黃色葡萄球菌同源性分析

房杰 孫蘭菊 宗春輝 馬量 邱奇 吳尚為

耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)是引起醫院內感染的重要病原菌，而重癥監護病房(ICU)是醫院內感染MRSA的高發區。我院ICU由于重視對MRSA的預防和控制，MRSA的分離率很低，2007年僅分離出MRSA 4例，但2008年3月近1周就分離出MRSA 3例，并且耐藥表型相似，因此利用脈沖場凝膠電泳對菌株同源性進行了回顧性研究，以便為醫院感染控制提供準確的實驗數據。

1 材料與方法

1.1 菌株來源 3株金黃色葡萄球菌(剔除重復菌株)分離自該院2008年3月ICU患者的痰標本，感染MRSA的3例患者均使用了呼吸機，并出現了肺感染，患者的一般情況見表1。

表1 ICU感染MRSA患者的一般情況

1.2 試劑與儀器 MH培養基購自天津金章新技術研究所，藥敏紙片購自英國Oxoide公司;葡萄球菌溶菌素(lysostaphin)為Sigma產品;溶菌酶，蛋白酶K購自QUAGEN，限制性內切酶SmaI為Takara公司產品;低熔點瓊脂糖，PFGE電泳專用瓊脂糖均為BioRad公司產品;Ladder購于New England;漩渦混合器購自上海精科實業有限公司;臺式離心機為SANYO公司產品;蛋白核酸測定儀購自Eppendorf AG公司，凝膠成像系統為BIO-RAD公司的Gel Doe凝膠成像系統。Bio-Rad CHEF MAPPERTM型電泳儀購于BioRad公司。

1.3 藥物敏感性試驗 采用K-B法測定金黃色葡萄球菌對17種抗菌藥物青霉素、氨芐西林、苯唑西林、頭孢西丁、慶大霉素、環丙沙星、左氧氟沙星、復方新諾明、紅霉素、克拉霉素、克林霉素、四環素、利福平、喹奴普汀/達福普汀、利奈唑胺、萬古霉素及替考拉寧的敏感性。以金黃色葡萄球菌ATCC 25923為藥敏質控菌株，結果按2007年CLSI規定判讀。

1.4 脈沖場凝膠電泳(PFGE)分型

1.4.1 樣本制備:挑取在TSA固體培養基上過夜培養的MRSA 2～3個菌落于5 ml TSB液體中37℃水浴搖床過夜培養。取500 μl菌液13 000 r/min離心2 min。棄上清加500 μl PIV，漩渦混合器混勻，13 000 r/min離心2 min，棄上清加200 μl PIV漩渦混合器混勻。用蛋白核酸測定儀OD620測光密度，1 000 μl PIV調零后將 5 μl菌液加入 1 000 μl PIV 中測定樣本菌含量(0.05～0.15)讀數用計算公式(40×OD600×210)-210計算出所需PIV量依次加入1.5 ml離心管。取150 μl菌液42℃ 10 min，1.5%低熔點膠42℃水浴，并將兩者1∶1混勻。取20 μl滴到載玻片上放好蓋玻片，-20℃ 5 min室溫10 min。

1.4.2 溶菌:1 ml Eclysis 37℃水浴3 h，吸出 Eclysis加1 ml ESP 50℃水浴至少17 h，13 ml TE搖床搖30 min，連續5次。

1.4.3 酶切:20 U SmaI過夜酶切，10×LB 5.5 μl終止反應。

1.4.4 跑膠:PFGE電泳專用瓊脂糖制膠。在CHEF Mapper XA system脈沖場電泳儀中電泳，電泳緩沖液為0.5×TBE，條件為電壓6 V/cm、角度60/-60、脈沖時間5 s、溫度14℃、時間23 h，用 Ladder作為分子量標準。

1.4.5 PFGE結果判讀:用EB染色后用Gel Doe凝膠成像系統掃描成像。PFGE圖譜結果判斷標準［1］:酶切后DNA條帶相差3條以內為同一克隆。

2 結果

2.1 藥敏結果 3株MRSA耐藥譜基本一致。3株菌株僅對萬古霉素、替考拉寧、利奈唑胺，喹奴普汀/達福普汀、復方新諾明敏感，對青霉素、氨芐西林、苯唑西林、頭孢西丁、慶大霉素、環丙沙星、左氧氟沙星、紅霉素、克拉霉素、克林霉素、四環素、利福平顯示出耐藥。

2.2 3株MRSA脈沖場凝膠電泳分型 PFGE結果顯示這3株菌株酶切條帶完全一致，是同一克隆株。見圖1。

3 討論

圖13 株MRSA的PFGE圖譜

MRSA是引起醫院內感染的重要病原菌，ICU的患者由于患者病情危重，生理防御功能衰退，使用呼吸機、動靜脈插管等侵入性操作繁多，破壞了人體的自然免疫力，為MRSA的侵入提供了條件。該研究中的3例患者由于年老體弱，患有嚴重的基礎病，并且又進行了氣管切開術，使用了呼吸機，存在嚴重的肺感染。多次痰培養均為混合菌感染。除MRSA外，還分離出肺炎克雷伯菌，銅綠假單胞菌，鮑曼不動桿菌等，所以使用了大量的廣譜抗生素，如亞胺培南、頭孢哌酮/舒巴坦、哌拉西林/他唑巴坦。當分離出MRSA后，又分別使用了萬古霉素或利奈唑胺。經過治療1號患者轉入呼吸科病房，后痊愈出院。2號患者死于肺感染。3號患者肺部感染得到控制后，家屬要求自動出院。調查顯示，呼吸機可能是造成此次MRSA暴發流行的主要途徑之一，患者的年老多病及廣譜抗生素的使用為MRSA的侵入提供了條件。

當出現3例耐藥譜相似的多重耐藥的MRSA后，細菌室及時反饋給感染科。感染科立即與ICU病房采取了相應的控制措施:嚴格管理制度;嚴格手部衛生;加強空氣與物品的消毒;加強醫療器械的消毒與處理;按照細菌體外藥敏結果，調整抗生素的使用等。結果在4、5月份均未分離出MRSA?？梢姙榭刂芃RSA交叉感染，嚴格無菌操作、加強消毒隔離措施，合理使用抗生素非常重要［2，3］。同時微生物室耐藥菌監測報告也是防控MRSA在院內流行的措施之一［4］。

PFGE是建立在限制性內切酶多態性分析基礎上的分型技術，具有分辨率高、費用相對較低等特點，常用于短時間、小范圍的流行病學調查。是當前國際上醫院感染爆發流行的診斷金標準，是追查病原菌傳染源和傳播途徑的有效方法。

1 Afzal-shah M，Woodford N，Livermore DM.Characterization of OXA-25，OXA-26，and OXA-27，molecular class D betalactamse associated with carbapenem resistance in clinical isolates of acinetobacter baumannii.Antimicrob agents chemother，2001，45:583-588.

2 孫宏莉，王輝，陳民鈞.甲氧西林耐藥的金黃色葡萄球菌耐藥性及分子流行病學調查.中華微生物學和免疫學雜志，2005，25:137-141.

3 陳紅巖，唐玉分，孫嫣.重癥監護病房耐甲氧西林金黃色葡萄球菌感染的預防與控制.中華醫院感染學雜志，2009，19:2987-2988.

4 王靖，趙應蘭，楊愛芝.對耐甲氧西林金黃色葡萄球菌醫院感染的管理.中華醫院感染學雜志，2010，20:297.