高糖誘導的視網(wǎng)膜膠質(zhì)細胞凋亡以及牛磺酸的防護效應研究

曾凱宏，楊詠濤，王靜，余雪梅，崔越

（四川省醫(yī)學科學院·四川省人民醫(yī)院臨床營養(yǎng)科，四川 成都 610072）

0 引言

近年來，糖尿?。―M）的發(fā)病率正以驚人的速度增長。視網(wǎng)膜病變（DR）是糖尿病的常見并發(fā)癥，也是導致成年人失明的主要原因之一。目前，治療DR的主要方法為全視網(wǎng)膜光凝固法，但療效并不理想。因此，尋找一種新的預防和治療DR的方法十分必要。盡管DR一直被視為一種血管變性疾病，但近期的研究提示DR也是一種神經(jīng)變性疾病。

DR的早期病變包括視網(wǎng)膜電圖改變、膠質(zhì)細胞反應性增生以及谷氨酸興奮毒性等。動物研究表明，在DR發(fā)生的早期，視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞已開始凋亡。STZ誘導糖尿病大鼠7個月后，可觀察到視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞數(shù)目明顯減少，同時視網(wǎng)膜內(nèi)叢狀層和內(nèi)核層變薄，以內(nèi)叢狀層的變化較為明顯［1］。對糖尿病患者的觀察發(fā)現(xiàn)，糖尿病早期視網(wǎng)膜Müller細胞功能發(fā)生改變，且Müller細胞中Bcl-2的表達下調(diào)［2］。

圖1 GS、GLAST和vimentin聯(lián)合鑒定膠質(zhì)細胞

?；撬崾谴嬖谟谏攀持械囊环N人體半必需氨基酸，大量攝入尚未發(fā)現(xiàn)毒性反應。牛磺酸在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中可作為滲透壓調(diào)節(jié)劑和抑制性神經(jīng)調(diào)質(zhì)。研究者很早就發(fā)現(xiàn)，?；撬崮軠p輕癲癇病的癥狀，近年來，研究者發(fā)現(xiàn)?；撬徇€具有神經(jīng)保護作用［3］。目前，較多的學者關注牛磺酸對于糖尿病并發(fā)癥的預防作用。個別研究提示，?；撬峥山档脱趸瘧?，預防實驗性 DR［4］。

本研究利用體外培養(yǎng)的大鼠視網(wǎng)膜膠質(zhì)細胞高糖模型，觀察高糖和?；撬釋δz質(zhì)細胞凋亡的影響，深入探討?；撬岜Ｗo糖尿病引起視網(wǎng)膜損傷的機制。

1 材料和方法

1.1 材料

出生后3～5d的SD大鼠7只，由本院實驗動物中心提供。?；撬幔罕本┦兰o維他生物技術有限公司，純度＞95%；胎牛血清：蘭州民海；DMEM/F12、胰酶：美國Gibco公司；D-glucose：Sigma公司；抗谷氨酰胺合成酶（GS）一抗：Sigma公司；波紋蛋白（vimentin）：武漢博士德；抗谷氨酸轉運蛋白（GLAST）一抗：Sigma公司；熒光二抗羅丹明、FITC：北京中杉生物技術有限公司；Hoechst：北京碧云天生物公司產(chǎn)品；Annexin-V檢測試劑盒：羅氏公司。

1.2 方法

1.2.1 SD大鼠視網(wǎng)膜膠質(zhì)細胞的純化培養(yǎng)及鑒定

出生后3～5d的新生SD大鼠，用750mL/L酒精浸泡消毒同時麻醉，無菌條件下摘取眼球，用雙抗PBS漂洗數(shù)遍，小心剝離視網(wǎng)膜，加入5g/L胰蛋白酶，37℃消化20～30min，充分吹打，加入含200mL/L血清的培養(yǎng)基終止消化，不銹鋼網(wǎng)過濾，1000r/min離心3～5min，培養(yǎng)基重懸、離心，反復2次。去上清后加入含200mL/L血清的培養(yǎng)基制細胞懸液，調(diào)整細胞濃度為3×108個/L，接種于25cm2培養(yǎng)瓶中。細胞鑒定采用膠質(zhì)細胞標志物GS、GLAST和vimentin聯(lián)合，免疫細胞熒光雙標鑒定。

免疫細胞化學雙染步驟為：細胞爬片以40g/L多聚甲醛固定30min，PBS漂洗5min×3次，用含10g/L BSA、5mL/L TritonX-100的 PBS緩沖液孵育30min，同前漂洗后，用含50～100mL/L正常羊血清的PBS緩沖液孵育10min，加1∶2000稀釋的 Anti-GS或 Anti-GLAST，4℃過夜（同時設 PBS替代一抗的空白對照和正常羊血清替代一抗的替代對照），PBS漂洗后與羅丹明標記的熒光二抗37℃孵育30min，PBS漂洗后加1∶200稀釋的Anti-vimentin，37℃，2h，PBS漂洗后與FITC標記的熒光二抗37℃孵育30min，PBS漂洗后加Hoechst于37℃孵育5min，PBS緩沖液漂洗后，900mL/L甘油封片，激光共聚焦顯微鏡觀察照相。

圖2 ?；撬嵊绊戵w外高糖誘導的大鼠視網(wǎng)膜膠質(zhì)細胞凋亡的流式圖

圖3 ?；撬釋w外高糖誘導的大鼠視網(wǎng)膜膠質(zhì)細胞凋亡率的影響

1.2.2 高糖模型建立及實驗分組 待細胞達80%融合時，棄掉含血清的培養(yǎng)液，換無血清的培養(yǎng)液培養(yǎng)24h，再換成含不同濃度葡萄糖和?；撬崤囵B(yǎng)。實驗分10組，分別是：正常對照組（含5mmol/L葡萄糖，Con）；?；撬釋φ战M（5mmol/L葡萄糖＋0.1、1、10mmol/L?；撬?，Con＋0.1、1、10mmol/L Tau）；高糖模型組：（含25mmol/L葡萄糖，HG）；牛磺酸干預高糖組（25mmol/L葡萄糖＋0.1、1、10mmol/L?；撬?，HG＋0.1、1、10mmol/L Tau）；甘露醇對照組（5mmol/L、25mmol/L 葡萄糖＋20mmol/L mannitol，mannitol、HG＋mannitol）。

1.2.3 Annexin-V/PI雙染結合流式細胞檢測技術檢測視網(wǎng)膜膠質(zhì)細胞凋亡 分組后的細胞培養(yǎng)96h后，用 Annexin-V 結合緩沖液漂洗，然后加入Annexin-V染色液，于37℃避光孵育10min，用鈣結合緩沖液漂洗后，加入10μl PI，4℃孵育10min，采用流式細胞檢測技術檢測膠質(zhì)細胞的凋亡情況。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

所有數(shù)據(jù)均以平均數(shù)±標準差表示，用單因素方差分析差異顯著性，采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件處理結果。

2 結果

2.1 膠質(zhì)細胞的原代培養(yǎng)及鑒定

接種24h后，細胞部分融合，成簇生長，貼壁不緊；培養(yǎng)3d后，細胞貼壁緊，60%融合，形成集落，呈圓球形，部分細胞從圓球形底部伸出突觸；培養(yǎng)6d后，細胞大部分融合，胞體呈纖維形，核圓形或橢圓形；混養(yǎng)的大鼠視網(wǎng)膜細胞培養(yǎng)至第9d時，下層細胞鋪滿瓶底，細胞與細胞之間相互連接，形成毯狀，以膠質(zhì)細胞特征性標識物 GS、GLAST和vimentin聯(lián)合對細胞進行鑒定，核用Hoechst復染。圖1顯示，該培養(yǎng)體系中98%以上的細胞3種抗體染色呈陽性。

2.2 ?；撬釋Ω咛钦T導的大鼠視網(wǎng)膜膠質(zhì)細胞凋亡的影響

采用Annexin-V/PI雙染結合流式細胞檢測技術檢測體外培養(yǎng)的大鼠視網(wǎng)膜膠質(zhì)細胞凋亡。與正常對 照 組 相 比 （5mmol/L 葡 萄 糖），在 高 糖（25mmol/L葡萄糖）培養(yǎng)的48h內(nèi)，未觀察到明顯的膠質(zhì)細胞凋亡（數(shù)據(jù)未顯示）；圖2、3所示，用高糖（25mmol/L葡萄糖）培養(yǎng)72h后，與正常對照組相比，高糖組膠質(zhì)細胞凋亡明顯。高糖組早期凋亡細胞百分率為20.6%；加入0.1、1、10mmol/L?；撬岣深A后，高糖組細胞凋亡率分別降低至16.4%、5.7%和7.6%，牛磺酸干預組膠質(zhì)細胞凋亡率明顯低于高糖未干預組（P＜0.05）；不同濃度的?；撬釋φ战M與正常對照組膠質(zhì)細胞凋亡率無明顯差異（P＞0.05）；甘露醇處理不改變正常葡萄糖和高葡萄糖組細胞的凋亡率（P＞0.05）。

3 討論

糖尿病視網(wǎng)膜病變（DR）是常見且嚴重的糖尿病眼部并發(fā)癥，也是四大主要致盲疾病之一。隨著DM發(fā)病率的不斷上升，DR的危害亦日趨明顯。DR的病因目前還不是十分清楚，而高血糖是發(fā)病的主要原因［1］。目前，研究者對DR多采用動物模型進行體內(nèi)實驗研究，在體外建立視網(wǎng)膜膠質(zhì)細胞高糖模型，模擬體內(nèi)DM微環(huán)境，排除體內(nèi)其它因素的干擾，在DM病程的特殊時期直接觀察細胞的變化，這些是體內(nèi)動物實驗所無法取代的。大量的實驗發(fā)現(xiàn)，體外培養(yǎng)中25～30mmol/L的高糖濃度可近似地模擬糖尿病患者體內(nèi)的高糖狀態(tài)，本實驗采用25mmol/L葡萄糖濃度作為模擬體內(nèi)絕對高糖狀態(tài)的適宜濃度。

早期的研究大多集中于糖尿病視網(wǎng)膜微血管的改變方面，認為是微血管病變引起了視網(wǎng)膜神經(jīng)的改變。近年來，研究者通過試驗發(fā)現(xiàn)，糖尿病初期視網(wǎng)膜微血管并未發(fā)生改變，在發(fā)病6個月后才能夠檢測到這一改變，而在此之前視網(wǎng)膜神經(jīng)元已發(fā)生改變［5，6］。上述發(fā)現(xiàn)使人們意識到，DR的發(fā)病原因可能并非如最初所設想的那樣，視網(wǎng)膜神經(jīng)網(wǎng)膜的改變發(fā)生在血管病變之前，并且神經(jīng)網(wǎng)膜的改變可能進而引起微血管的改變。有學者發(fā)現(xiàn)，糖尿病發(fā)病6個月時外核層出現(xiàn)明顯細胞凋亡，在水平細胞、無長突細胞和神經(jīng)節(jié)細胞中均可檢測到不同程度的細胞壞死現(xiàn)象。糖尿病4周時可發(fā)生光感受器的凋亡，并且隨病程的進展，凋亡細胞數(shù)將增加［5］。本研究通過體外25mmol/L高糖培養(yǎng)大鼠視網(wǎng)膜膠質(zhì)細胞發(fā)現(xiàn)，與正常對照組相比，高糖培養(yǎng)后大鼠視網(wǎng)膜膠質(zhì)細胞的凋亡率明顯上升。

?；撬崾且环N酸性氨基酸，主要存在于心臟、視網(wǎng)膜、腦和骨骼肌中，白細胞和血小板中?；撬釢舛纫草^高。近年來，?；撬岬纳碜饔檬艿皆絹碓蕉嗟年P注。有人發(fā)現(xiàn)，貓膳食中缺乏?；撬釙r會發(fā)生視網(wǎng)膜疾病，靈長類動物試驗也得到了類似的結論。孕婦膳食缺乏?；撬釙r會導致母子視網(wǎng)膜疾患，當膳食中補充牛磺酸時癥狀又會消失［7］。給予糖尿病病人早期治療可以減少其并發(fā)癥的發(fā)生，從而減少死亡率。那么?；撬崾欠衲軠p少糖尿病的死亡率呢？有人比較了牛磺酸和維生素E加硒后發(fā)現(xiàn)，維生素E加硒不能降低糖尿病的死亡率，但?；撬釀t可以明顯提高患者的存活率。胰島素依賴性和非胰島素依賴性糖尿病患者的血漿和血小板中牛磺酸含量均下降［8，9］。本研究通過體外實驗發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)基中加入0.1、1、10mmol/L牛磺酸干預后，高糖組細胞凋亡率由20.6%分別降為16.4%、5.7%和7.6%，干預組的細胞凋亡率明顯低于高糖未干預組。

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