成膜基質對氟化物涂膜抑制釉質早期齲的效果

桂亞婕，趙信義，侯紹杰，李雅萍，張文彥

(第四軍醫大學口腔醫院，陜西西安710032)

氟化物涂膜(fluoride varnish)又稱為氟涂膜或氟涂漆，是一種含有較高濃度氟的局部用緩釋氟防齲材料，常用于兒童或齲病高發人群。涂在牙齒表面后，氟化物涂膜可粘附于牙面一段時間，此期間能緩慢釋放較高濃度的氟離子，部分氟離子進入釉質中與羥基磷灰石的羥基置換，使羥基磷灰石轉換為氟磷灰石，后者具有更強的抗酸蝕性能，從而提高釉質的抗齲損性能［1-2］。氟化物涂膜的這種性能與其緩釋氟性能密切相關，而后者又與其載體—成膜基質密切相關［3］。

本研究通過釉質表面定量光誘導熒光分析、表面顯微硬度測定和截面顯微偏光觀測等方法，分析比較成膜基質對氟化物涂膜抑制釉質早期齲的效果，以期為研制新型氟化物涂膜提供實驗基礎。

1 材料和方法

1.1 實驗材料、儀器和相關試劑配制

1.1.1 主要材料和儀器

滲透型丙烯酸樹脂(Eudragit RL100，Evonik R?hm GmbH，德國);珂巴樹脂(Copal resin，杭州奧圓工貿有限公司);聚合松香(福建武平林產化工廠);聚乙烯醇縮丁醛(成都市科龍化工試劑廠);甲基丙烯酸乙酯共聚樹脂(上海九龍精細化工有限公司);市售氟化物涂膜:Duraphat(含50 g/L氟化鈉，Colgate Oral Pharmaceuticals，UK);SYJ-150A低速金剛石切割機(沈陽科晶設備制造有限公司);X-1000型顯微硬度計(上海秦明光學儀器公司);Leica DM6000B研究級顯微鏡和所帶Las AF軟件(德國);XP-330C偏光顯微鏡(上海蔡康光學儀器有限公司)。

1.1.2 氟化物涂膜材料配制

分別稱取定量的滲透型丙烯酸樹脂、珂巴樹脂、聚合松香、聚乙烯醇縮丁醛、甲基丙烯酸乙酯共聚樹脂，各加于分散有定量氟化鈉(分析純)的乙醇中，制成5種含氟化鈉5wt%、相應成膜基質20 wt%的溶劑揮發快干型氟化鈉涂膜材料，使用前需充分搖勻［3］。

1.1.3 脫礦液和再礦化液(pH循環液)的配制

參照文獻［4］配制。脫礦液:2.0 mmol/L Ca(NO3)2·4H2O、2.0 mmol/L NaH2PO4·2H2O、0.075 mol/L 醋酸緩沖液、0.04 mg/L F-，用濃鹽酸調 pH 值至 4.7。再礦化液:1.5 mmol/L Ca(NO3)2·4H2O、0.9 mmol/L NaH2PO4·2H2O、0.15 mol/L KCl、0.02 mol/L 二甲砷酸鹽緩沖液、0.05 mg/L F-，用濃鹽酸調 pH 值至 7.0。

1.2 方法

1.2.1 釉質試樣的制備和相關指標基線的測定

選擇近1個月拔除的釉質發育正常、無缺損、隱裂的牛上頜切牙，切除牙根，取牙冠充分清潔后，用低速金剛石切割機切割成5 mm×5 mm×3 mm的小塊，分別用自凝樹脂包埋并暴露唇面釉質。然后分別用#800、#1200、#2000碳化硅水砂紙在注水下依次磨拋釉質面，最后用粒度為1.0 μm的金剛石拋光膏拋光至鏡面狀，超聲清洗，在體視顯微鏡下確認釉質表面無裂紋后將每個釉質塊表面劃分為4個區域(圖1)。a區域為陽性對照區域，試驗過程中僅接受pH循環處理;b區域為試驗區域，pH循環前應用氟涂膜;c區域為陰性對照區域，試驗過程中表面覆蓋指甲油涂膜。

將上述制備的所有樣本分別用顯微硬度計，以維氏壓頭在載荷25 g，保荷10s［5］的條件下測定各釉質塊表面顯微硬度(surface microhardness，SMH)。每個釉質塊表面每個區域測3個點，各點相距100～200 μm，結果取平均值，記為SMH0。然后從中挑選SMH 值在330～390 kg/mm2［6］范圍的釉質塊90個，分別置熒光顯微鏡下，以波長355～425 nm的紫外光照射釉質表面，并以曝光250、飽和度100、亮度5、增益系數5、多色帶通濾光鏡255 nm、吸收濾光片270 nm等參數拍攝釉質表面熒光圖像;通過系統自帶軟件(Las AF，德國)成圖并測量各試樣表面各區域的平均灰度值F0(gray values)。

圖1 釉質試樣塊表面分區示意圖

1.2.2 不同成膜基質，氟化物涂膜對釉質早期齲的抑制效果

1.2.2.1 釉質試樣塊的試驗分組和處理

將經基線檢測的90個釉質試樣塊按不同氟化物涂膜材料隨機分成6組，每組15個，并在各組每個試樣塊表面的a、c區域涂布兩層抗酸指甲油，吹干后再在各組試驗區域(b區)用小毛刷按分組涂布相應的氟化物涂膜材料，涂布后立即置37℃、100%濕度環境中。12 h后取出，用無脂棉簽蘸丙酮液徹底溶解除去氟化物涂膜和指甲油涂膜，超聲清洗并吹干后，重新在c區域表面涂布兩層抗酸指甲油。然后將所有試樣塊置pH循環液中循環7 d，前5 d每天先浸泡于脫礦液6 h后，再浸泡于再礦化液17 h;最后2 d全部浸泡于再礦化液中。pH循環在37℃恒溫振蕩水浴箱中進行，單位面積(mm2)釉質暴露面需脫礦液 2.22 mL，再礦化液 1.11 mL［7］，每天更換 1 次新的 pH 循環液，每次換液前和循環結束后均用去離子水徹底沖洗各試樣表面。

1.2.2.2 pH循環結束后釉質試樣的熒光值、顯微硬度值和脫礦深度的測定

pH循環結束后，用丙酮液去除所有樣本表面指甲油涂膜，大量去離子水沖洗并干燥后，分別置熒光顯微鏡下再次觀測表面各區域的平均灰度值F1(觀測參數同前)。以每個釉質試樣塊同一區域pH循環前后兩次測得的灰度值之差表示各區域的熒光損失量，并由下式計算平均熒光損失率之后再按前述相同的方法測定每個釉質表面各區域的顯微硬度，記為SMH1，并由下式計算各區域pH循環后表面顯微硬度的下降率

最后將每個試樣于a、b區域分界處垂直切開，分別用自凝塑料包埋切開的兩塊釉質試樣并暴露剖面后，用硬組織切片機制備厚100 μm的釉質切片(圖1)。每個釉質塊制備3張切片，用中性樹脂膠封片后于偏光顯微鏡下觀察并拍照，在電腦上用測量軟件(DL-3000，上海蔡康光學儀器有限公司)測量釉質表層下脫礦的深度，每個切片測量5個點取均值。

1.3 統計學分析

采用SPSS 13.0統計軟件進行統計分析，釉質塊各個區域pH循環前后釉質表面灰度值、SMH比較用配對t檢驗;各組△F%、△SMH%和脫礦深度采用單因素方差分析，組間多重比較采用LDS-t檢驗，檢驗水準 α =0.05。

2 結果

2.1 pH循環前后各組釉質表面熒光值和熒光損失量的比較(圖2，表1)

pH循環前各組基線灰度值(F0)基本一致，組間均無統計學差異(P＞0.05);pH循環后，除陰性對照區域(c區)外，各組陽性對照區域(a區)和試驗區域(b區)熒光值(F1)均較基線顯著下降，差異有統計學意義(P＜0.05);不同組間熒光損失率(△F%)相比，各組試樣的陰性對照區域均顯著小于陽性對照區域和試驗區域(P＜0.05);而且各組試驗區域均顯著小于陽性對照區域(P＜0.05)，說明pH循環能夠使釉質發生脫礦，在釉質表面應用氟化物涂膜，能夠顯著提高釉質的抗脫礦能力。

6種成膜基質氟化物涂膜材料組間△F%相比，以滲透型丙烯酸樹脂基質組的熒光損失率最小，與其他5組相比差異均有統計學意義(P＜0.05);而Duraphat組、珂巴樹脂組、聚乙烯醇縮丁醛組和聚合松香組次之，甲基丙烯酸共聚樹脂組的平均熒光損失量最大，但5組間均無統計學差異(P ＞0.05)。

表1 pH循環前后各組試樣各區域平均熒光值和熒光損失率的比較(s)

表1 pH循環前后各組試樣各區域平均熒光值和熒光損失率的比較(s)

*與同一組pH循環前相比P＜0.05;不同字母為各組間熒光損失率相比P＜0.05

F%珂巴樹脂組 231.73 ±26.89 120.41 ±39.56* 49.80 ±15.18分組 F0 F1 △A滲透型丙烯酸樹脂組 243.64 ±19.63 158.93 ±33.60* 36.78 ±13.44B甲基丙烯酸乙酯共聚樹脂組 236.08 ±16.86 102.96 ±27.89* 56.84 ± 9.09A聚合松香組 241.88 ±19.78 108.79 ±24.52* 56.01 ± 8.43A聚乙烯醇縮丁醛組 221.02 ±29.76 107.26 ±25.42* 51.71 ±14.81A Duraphat組 229.29 ±21.73 113.92 ±35.24* 50.75 ±11.60A陽性對照區域(a區)247.97 ±17.82 62.51 ±13.27* 74.79 ± 8.84C陰性對照區域(c區)253.45 ±4.02 241.85 ±13.93 4.58 ± 4.86D

2.2 pH循環前后各組釉質表面顯微硬度的比較(表2)

pH循環前，各組基線顯微硬度值(SMH0)基本一致，組間均無統計學差異(P＞0.05);pH循環后，除陰性對照區域(c區)外，各組陽性對照區域(a區)和試驗區域(b區)硬度值(SMH1)均較基線明顯下降，差異有統計學意義(P＜0.05);不同組間顯微硬度下降率(△SMH%)相比，相對于陰性對照區域，陽性對照區域和試驗區域的硬度值雖均有明顯下降(P＜0.05)，但各組試驗區域的下降率均明顯小于陽性對照區域(P＜0.05)，說明氟化物涂膜對釉質有明顯的保護作用。

6種成膜基質氟化物涂膜材料組間△SMH%相比，滲透型丙烯酸樹脂氟涂膜組的△SMH%最小，甲基丙烯酸共聚樹脂組最大，各分別于其他5組相比差異均有統計學意義(P＜0.05);Duraphat組、珂巴樹脂組、聚合松香和聚乙烯醇縮丁醛組之間相比差異均無統計學意義(P＞0.05)。

表2 pH循環前后各組試樣各區域表面顯微硬度比較(kg/mm2s)

表2 pH循環前后各組試樣各區域表面顯微硬度比較(kg/mm2s)

*與同一組pH循環前相比P＜0.05;不同字母為各組間△SMH%相比P＜0.05

SMH%珂巴樹脂組 354.32 ±8.57 157.08 ±36.95* 55.62 ±10.55分組 SMH0 SMH1 △A滲透型丙烯酸樹脂組 351.18 ±11.23 188.17 ±32.30* 49.28 ± 9.91B甲基丙烯酸乙酯共聚樹脂組 355.13 ±11.24 135.62 ±29.70* 61.76 ± 8.60C聚合松香組 350.00 ±8.71 147.59 ±36.69* 57.90 ±10.08A聚乙烯醇縮丁醛組 350.30 ±15.52 147.20 ±35.69* 57.88 ±13.19A Duraphat組 351.61 ±8.67 153.63 ±38.00* 56.38 ±10.38A陽性對照區域(a區)352.51 ±14.23 49.83 ±12.02* 85.95 ± 3.50D陰性對照區域(c區)351.62 ±15.22 346.98 ± 9.45 2.30 ± 1.68E

2.3 pH循環后各組脫礦深度的比較(表3)

偏光顯微鏡下可見正常釉質呈負性雙折射(透光)(圖3A);試驗區域和陽性對照區可見以表層下脫礦為主要特征的病理改變，呈負性雙折射的表層和緊接下面呈正性雙折射(不透光)的病損體部;與陽性對照區相比，試驗區域脫礦深度相對較淺，病損體部出現負性雙折射的再礦化干涉條帶，部分切片還可觀察到呈負性雙折射的透明層(圖3B-H)。脫礦深度測量結果顯示:各組試驗區域(b區)的脫礦深度均顯著小于陽性對照區域(a區)(P＜0.05);不同成膜基質氟涂膜處理釉質表面脫礦深度相比，滲透型丙烯酸組的脫礦深度顯著小于其他涂膜組(P＜0.05);甲基丙烯酸共聚樹脂組與聚合松香組的脫礦深度無顯著性差異(P＞0.05)，但均顯著大于其他涂膜組(P ＜0.05);Duraphat組、珂巴樹脂組和聚乙烯醇縮丁醛組的脫礦深度介于中間，且三者間無顯著性差異(P＞0.05)。

圖2 6組試樣塊pH循環后的熒光圖像

圖3 各組試驗區域和陽性對照區域釉質表面典型早期齲的顯微偏光圖像

表3 pH循環后各組釉質表面脫礦深度比較(μms)

表3 pH循環后各組釉質表面脫礦深度比較(μms)

不同字母組間P＜0.05

分組 脫礦深度珂巴樹脂組 64.31 ± 3.49A滲透型丙烯酸樹脂組 45.88± 2.51B甲基丙烯酸乙酯共聚樹脂組 89.31± 7.09C聚合松香組 73.15 ±13.21C聚乙烯醇縮丁醛組 66.71± 7.86A Duraphat組 60.12 ±15.96A陽性對照區域(a區)184.72± 2.02D

3 討論

口腔環境中釉質齲的形成過程是脫礦與再礦化的動態失衡過程，所形成的釉質早期齲僅局限于釉質表層內，尚未造成釉質實質性缺損，其典型病理特征是釉質表面層損壞極少而相對完整，表面層下方釉質脫礦明顯。本研究采用體外pH循環法模擬口腔內釉質齲損的形成過程，結果顯示，所形成的齲損符合釉質早期齲的病理特征，說明體外pH循環法能有效形成與體內相似的齲損形成環境。

牙齒硬組織具有自發熒光性，即在某些波長的光線照射后能夠發出熒光，而且其熒光強度與硬組織中的礦物質含量具有一定的正相關關系，因此，測定釉質表面的熒光強度，可定量反映釉質脫礦程度［8-9］。根據這一原理，實驗所使用的 Leica DM6000B研究級顯微鏡采用高壓汞燈為激發光源，配備有精確控制激發光強度的控制系統，以保證每次進行熒光測定時各種條件的一致性;同時還配有高過濾光鏡和吸收濾光片，不僅能消除所選波段外其他光源的干擾，還可有效過濾反射光，以確保測定結果的準確性，并且還配備有適用于熒光拍照的單色高分辨率冷CCD，能夠精確記錄釉質熒光圖像。該方法測定快速、簡便;重復性、量化性好;測定區域大;結果的代表性強;不破壞試樣［10］;且所得結果與傳統顯微X線透射法有高度的一致性。

顯微硬度和釉質截面顯微偏光觀測都是經典的釉質脫礦觀測方法。本研究發現:雖然早期釉質齲表面為“完整表層”，但所測定的齲損表面顯微硬度值明顯降低。這可能是由于釉質表面在菌斑作用下發生早期溶解，礦物質喪失，而產生孔隙并不斷擴大所導致的表層組織疏松的緣故［11］。結果與熒光顯微鏡相符，說明此時表面層已發生病理性破壞。

顯微偏光觀測根據其具有非均質性超顯微結構的礦物質或晶體都具有雙折射的特性，不僅可以測量齲損的深度，同時還可反映齲損的范圍和形態［12］。本研究測定結果顯示:pH循環液能導致釉質表層下約184.72 μm深度范圍內脫礦，使用氟化物涂膜后僅41.45～103.09 μm 深度不等的脫礦，脫礦深度以滲透型丙烯酸組最淺(P＜0.05)，即其抗脫礦效果最好。

本研究在實驗設計上采用自身對照，同一個釉質試樣塊上既有陰性對照區也有陽性對照區，可事先對影響實驗的因素加以控制，使之盡可能均衡，減少誤差，從而保證了結果的可靠性。同時運用自身配對，即以同一試樣在實驗前后兩次結果的差值，并換算出其變化率作為統計分析指標，避免了不同試樣之間的不均一性對結果的干擾，增強了組間可比性。實驗發現，所用5種氟化物涂膜均能有效提高釉質抗脫礦性能。雖然其氟化物含量均相同，但提高釉質的抗脫礦性能卻不同，說明成膜基質對氟化物的抗脫礦效果有明顯影響。我們先前的研究結果表明［3］:成膜基質對氟化物的釋放性能有明顯影響，不同成膜基質氟化物涂膜的短期(24 h內)釋氟率的順序與本研究測定的提高釉質抗脫礦能力的順序基本吻合。說明氟化物涂膜的釋氟性能是影響其提高釉質抗脫礦能力的重要因素。

氟化物涂膜主要由氟化物、成膜基質和揮發性溶劑組成，其中成膜基質是氟化物的緩釋載體，通常要求成膜基質有一定的強度和吸水性，以便吸水后能緩慢釋放防齲活性物質，其主要作用就是使涂膜粘附于釉質表面和賦予氟離子的緩慢釋放［13］。

從涂膜基質的化學結構和性能來看，滲透型丙烯酸樹脂是一種醇溶性藥用緩釋高分子材料，其化學結構中含有強親水性基團-季胺鹽基團［14］，不溶于水，但在水中可溶脹，形成一種親水性骨架型緩釋系統，滲透性強。珂巴樹脂是一種由熱帶樹木分泌的天然樹脂，在水中有一定的溶解性和良好的溶脹性，在溶脹過程中吸收水分導致所含的氟化物溶解，釋放氟離子［15］。聚乙烯醇縮丁醛是一種醇溶性樹脂，不溶于水，但其分子結構上含有一定量的親水性基團羥基，形成不溶性緩釋骨架系統，且具有優良的粘附性，能在牙齒表面保留較長時間。聚合松香是松香的低聚物，主要成分是樅酸型樹脂酸的二聚體［16］，親水性基團較少，性能穩定。甲基丙烯酸乙酯共聚樹脂是甲基丙烯酸乙酯與甲基丙烯酸的低分子量共聚物，親水性基團少，水中滲透性也較小，屬于疏水性緩釋骨架材料［14］。Duraphat是一種糊狀氟涂膜材料，其有效成分為50 g/L氟化鈉，并以中性松香樹脂作為成膜材料，松香樹脂在分子結構上具有共軛雙鍵和典型羧基，有一定的親水性。由此可見，不同成膜基質在化學結構上的差異，可能會導致其滲透吸水性的不同，從而影響涂膜中氟化物的溶解和氟離子的釋放。最終導致相同氟含量不同成膜基質的氟化物涂膜抗脫礦效果的差異。

綜上所述，氟化物涂膜對于抑制釉質早期齲的能力與其成膜基質密切相關，本實驗選用的6種氟涂膜雖均能促進釉質再礦化，抑制早期齲的形成和發展，但效果不同，以滲透型丙烯酸樹脂為基質的氟涂膜效果較好。

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