高血壓增加循環(huán)中CXCR4＋細胞而促進新生內(nèi)膜形成☆

廖松潔龔瓊陳健聰 曾意萱余劍

頸動脈狹窄的手術治療有助于降低缺血性卒中的發(fā)病風險性［1］，但是內(nèi)膜損傷所致術后再狹窄卻嚴重影響了手術療效［2］。高血壓是再狹窄的一大危險因素，具體機制卻尚不清楚。新生內(nèi)膜是血管再狹窄的病理標志［3］，以大量表型改變的血管平滑肌細胞（vascular smooth muscle cells，VSMCs）在局部堆積為特征［4］，它們主要來源于骨髓血管平滑肌祖細胞和血管中膜VSMCs［5］。趨化因子調(diào)控著血管平滑肌祖細胞從骨髓向血管的募集過程，其中，CXC趨化因子即基質(zhì)細胞衍生因子-1α（stromal cell-derived factor-1，SDF-1α） 及其受體 CXCR4 的作用尤為重要，直接介導新生內(nèi)膜的形成［5－6］。我們利用易卒中型腎血管性高血壓大鼠（stroke-prone renovascular hypertensive rats，RHRSP）制作頸總動脈內(nèi)膜剝除模型，探討高血壓對新生內(nèi)膜的影響和CXCR4在其中的可能作用。

1 資料與方法

1.1 動物與模型 采用體質(zhì)量為80～100 g雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠（廣東省動物實驗監(jiān)測所，許可證號：SCXK粵2009-0011）作為實驗動物。按雙腎雙夾法［7］復制 RHRSP，正常血壓對照組暴露雙側(cè)腎動脈，但不夾腎動脈。采用鼠尾動脈測量法每周測量一次動物的收縮壓。術后12～16周，選取收縮壓穩(wěn)定在180 mm Hg以上、無自發(fā)性卒中表現(xiàn)的RHRSP，行左側(cè)頸總動脈內(nèi)膜剝除術。正常情況下覆蓋于血管內(nèi)表面的完整內(nèi)皮細胞能夠抑制新生內(nèi)膜形成，通過內(nèi)膜剝除促使病理性新生內(nèi)膜形成已成為一種公認的研究血管再狹窄的動物實驗方法。按球囊擴張法復制頸總動脈內(nèi)膜剝除模型［8］，暴露和分離左側(cè)頸總、頸外和頸內(nèi)動脈后，結扎頸外動脈遠端，暫時阻斷頸內(nèi)動脈和頸總動脈近端血流。在頸外動脈中段作一動脈切口，將球囊導管（Fogarty，2F，Edwards Lifesciences，USA）小心插入頸總動脈，注入生理鹽水使球囊充滿后，螺旋式反復旋出三次破壞動脈內(nèi)膜。取出球囊導管，結扎頸外動脈近端。確定血流恢復并且頸總動脈搏動良好后，縫合切口。

1.2 動脈形態(tài)學及組織化學分析 分別于頸總動脈內(nèi)膜剝除術后1、2周處死動物，以4%多聚甲醛經(jīng)左心室灌注，取雙側(cè)頸總動脈，置于4%多聚甲醛浸泡固定8 h后于30%蔗糖溶液4℃脫水過夜。將血管平分為4段，包埋于OCT中，從遠端向近端行冰凍切片，片厚 12 μm，間隔 100 μm。

1.2.1 新生內(nèi)膜的形態(tài)學分析［9，11］從 2 周組的4段血管的遠端各取一張切片行H＆E（Vector Laboratories，Inc.）染色，顯微鏡下拍照后以 Image J軟件進行形態(tài)學分析，計算內(nèi)膜（管腔與內(nèi)彈力膜之間）、中膜（內(nèi)外彈力膜之間）面積和內(nèi)膜/中膜面積比，取4張切片的平均值。以對側(cè)非損傷動脈作為對照。

1.2.2 免疫組化分析 以1%小牛血清室溫孵育1小時后加入小鼠抗大鼠 CD31一抗 （1∶40，BD Pharmigin）特異性標記內(nèi)皮細胞、小鼠抗大鼠α-SMA 一抗（1∶100，Abcam）標記 VSMCs，4℃過夜，分別加入FITC或Cy3標記的抗小鼠二抗 （1∶100，Vector Laboratories）室溫孵育30 min。于熒光顯微鏡下拍照后以Image J軟件進行定量分析。再內(nèi)皮化%＝CD31陽性內(nèi)膜長度/管腔周徑×100%。

1.3 流式細胞學檢測 分別于頸總動脈內(nèi)膜剝除術后1、2周處死動物，取新鮮外周血。裂解紅細胞后，混懸于含1%胎牛血清的PBS中，于冰上避光孵育兔抗大鼠 CXCR4 一抗（1∶100，Abcam）1 h。以上述PBS清洗2次后，加入FITC標記的抗兔二抗（1∶100，Abcam）冰上孵育 30 min。清洗后立即用于流式細胞儀檢測單個核細胞群中CXCR4＋細胞所占百分比。

2 結果

2.1 動物血壓 除20只正常血壓對照組外，共有40只大鼠進行了雙腎雙夾手術，其后存活并符合條件進入實驗的RHRSP 25只，最后完成頸總動脈內(nèi)膜剝除術的高血壓動物20只（其中2只在手術過程中死亡，3只在取標本時發(fā)現(xiàn)損傷頸總動脈內(nèi)血栓形成）。正常血壓對照組的血壓為 95.5±10.01 mm Hg，高血壓組的血壓為 203.36±17.31 mm Hg（P ＜ 0.05，n＝20）。

2.2 高血壓促進新生內(nèi)膜形成（圖1） 頸總動脈內(nèi)膜剝除后2周，新生內(nèi)膜形成于損傷血管的管腔內(nèi)面。與正常血壓組相比，高血壓組的新生內(nèi)膜面積顯著性增加（2.18±0.11 mm2；1.55±0.14 mm2，P＝0.013，n＝4）。

2.3 高血壓不影響動脈再內(nèi)皮化（圖2） 高血壓以及正常血壓組損傷后1周，內(nèi)皮細胞特異的CD31抗體標記顯示約90%的頸動脈內(nèi)膜區(qū)域已經(jīng)得到形態(tài)上的修復 （89.49%±2.57%；92.19%±1.71%，P ＞ 0.05，n＝4）。

2.4 高血壓時CXCR4的表達上調(diào)（圖3） 在頸總動脈內(nèi)膜剝除后，循環(huán)中的CXCR4＋細胞百分比增高，高血壓組在損傷后1周即達高峰，2周時略有回落，但均顯著性高于未損傷組 （損傷1周45.64%±3.30%； 30.11%±1.27%，P＝0.014；2 周43.30%±3.35%；30.11%±1.27%，P＝0.024，n＝3～5）；正常血壓組則逐漸增高，在損傷2周后才顯著性高于未損傷組（32.11%±4.11%； 20.91%±2.06%，P＝0.029，n＝3）。在未損傷和損傷后 1 周時，高血壓組的CXCR4＋細胞百分比均較正常血壓組顯著性增高（未損傷：30.11%±1.27%；20.91%±2.06%，P＝0.019；損傷1周：45.64%±3.30% ；28.28%±2.56%，P＝0.003，n＝3～5）。

2.5 VSMCs是新生內(nèi)膜的主要組成成分（圖4）高血壓頸總動脈內(nèi)膜剝除后14 d，以VSMC特異性的抗α-SMA抗體標記，可見VSMC廣泛存在于動脈內(nèi)膜和中膜，是新生內(nèi)膜的主要組成成分。

圖1 頸總動脈形態(tài)學分析

圖2 動脈再內(nèi)皮化（CD31抗體標記）。A.左側(cè)頸總動脈損傷后即刻或1周后的CD31抗體熒光標記圖像。100×，標尺＝200 μm。B.再內(nèi)皮化的定量分析。P＞0.05，n＝4

圖3 血循環(huán)中CXCR4＋細胞占總單核細胞的數(shù)目百分比。A.代表性圖例，M1代表CXCR4＋細胞區(qū)域。B.各組的定量分析結果。*與相應血壓的未損傷組比較P＜0.05，＃與相應時點的正常血壓組比較 P＜0.05，n＝3～5

圖4 標記α-SMA的動脈橫切面圖。紅色熒光為α-SMA陽性信號，代表VSMCs。左圖為高血壓非損傷組，右圖為高血壓損傷2周組。I：內(nèi)膜； M：中膜。100×，標尺＝200 μm

3 討論

本研究利用RHRSP制備左側(cè)頸總動脈內(nèi)膜剝除的動物模型，可更好地研究高血壓基礎上頸動脈再狹窄的發(fā)生和發(fā)展過程。結果發(fā)現(xiàn)高血壓促進頸總動脈內(nèi)膜剝除后新生內(nèi)膜形成，并增加內(nèi)膜剝除之前和之后早期循環(huán)中CXCR4＋細胞；與此同時，與正常血壓相比，高血壓并不從形態(tài)上影響頸總動脈內(nèi)膜剝除的內(nèi)皮細胞再生，新生內(nèi)膜的主要成分仍然是VSMCs。

頸動脈再狹窄在術后36個月內(nèi)的發(fā)生率可高達7.9%～14%［2］，對之進行再次外科手術所面臨的二次再狹窄的風險性仍然高達6%～14%［2］。CREST臨床研究顯示超過80%的頸動脈狹窄患者伴發(fā)高血壓［12］，而高血壓患者術后再狹窄的風險比無高血壓者增高將近一倍［13］，表明高血壓與頸動脈再狹窄有密切關系。動脈再狹窄以新生內(nèi)膜為病理性標志。我們的研究發(fā)現(xiàn)，高血壓促進頸總動脈內(nèi)膜剝除后新生內(nèi)膜形成，以VSMCs為主要成分。雖然已有研究發(fā)現(xiàn)，活性氧（reactive oxygen species，ROS）過度生成、內(nèi)皮祖細胞數(shù)目減少和功能受損、以及內(nèi)皮化延遲等因素可能參與促進高血壓時頸動脈新生內(nèi)膜形成［14－15］，但是目前卻尚不清楚高血壓如何促進新生內(nèi)膜的主要成分——VSMCs的堆積。

正常血壓時，VSMCs在新生內(nèi)膜的堆積與SDF-1α/CXCR4密切相關。頸動脈內(nèi)膜剝除后，早期VSMCs凋亡和缺氧誘導因子1α（hypoxia induced factor-1α，HIF-1α）的活化使 SDF-1α 在血循環(huán)中一過性表達增高，局部形成的濃度梯度可動員骨髓血管平滑肌祖細胞進入血循環(huán)；隨后，SDF-1α在損傷動脈局部的表達持續(xù)增高，與循環(huán)中血管平滑肌祖細胞表面的CXCR4受體結合，促使這些細胞向損傷部位募集、并分化為VSMCs，從而參與新生內(nèi)膜形成［5－6］，可見，SDF-1α /CXCR4 直接介導新生內(nèi)膜的形成。促進該通道的作用，如采用巨噬細胞集落刺激因子，能夠促進新生內(nèi)膜形成［16］；而抑制該通道的作用，如采用CXCR4基因敲除的動物［5］、或給予 CXCR4 特異性拮抗劑AMD3100［16］，則 能抑制新生內(nèi)膜形成，同時不影響再內(nèi)皮化。我們的研究顯示，高血壓組對照正常血壓組，在頸總動脈內(nèi)膜剝除之前和之后早期均見循環(huán)中CXCR4＋細胞的增多。因頸總動脈內(nèi)膜剝除后循環(huán)中增多的CXCR4＋細胞主要來源于骨髓細胞的動員，能夠募集到損傷動脈進而分化成為VSMCs，故推測早期血循環(huán)中CXCR4＋細胞的增加可能是高血壓促進新生內(nèi)膜形成的機制之一。

高血壓上調(diào)CXCR4可能與HIF-1α有關。CXCR4的配體，SDF-1α的啟動子包含兩個HIF-1α的結合位點，故在轉(zhuǎn)錄水平受HIF-1α的直接轉(zhuǎn)錄調(diào)控［17］。高血壓促使動脈中膜增厚，氧彌散距離加大，易于形成中膜缺氧帶而誘導 HIF-1α表達［18］，而損傷局部過度生成的ROS通過抑制HIF-1α降解過程中的羥基化而增加 HIF-1α 表達水平［15，19］。因此，高血壓具備上調(diào)HIF-1α的條件，可籍此調(diào)控SDF-1α的表達而促進動員CXCR4＋細胞進入循環(huán)。

本研究初步探討了高血壓促進頸動脈新生內(nèi)膜形成的可能機制，不足之處在于尚未能深入研究 SDF-1α的表達改變以及干預 SDF-1α/CXCR4通路對高血壓新生內(nèi)膜形成的影響。但是為進一步研究提供了可靠的基礎。

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