OAT在非小細胞肺癌中的表達及生物信息學分析

周丹菲 程西安 楊拴盈 明宗娟 李維 張秋紅 張玉萍

肺癌是目前世界上發病率和死亡率最高的惡性腫瘤[1]。因其缺乏有效的早期診斷方法[2]，70%-80%的患者確診時已是腫瘤中晚期，存在淋巴結轉移或遠處轉移。雖然目前的治療方式不斷進步和發展，但是肺癌患者的預后仍不盡人意，5年和10年生存率分別為14%和8%[3,4]。早期診斷和早期治療是改善患者預后、降低肺癌死亡率的關鍵。應用蛋白質組學的方法篩選肺癌早期診斷標志物和治療靶點是近期研究的熱點，但是至今尚無理想的生物標志物。本課題前期通過線粒體蛋白質組學研究，篩選出一系列差異蛋白。其中鳥氨酸氨基轉移酶（ornithine aminotransferase, OAT）在肺腺癌A549細胞和正常支氣管上皮細胞16HBE間的表達差異超過2倍。通過文獻復習，進一步發現OAT可能和肝細胞癌、胃癌、前列腺癌等其它腫瘤也存在相關性，而其與非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer, NSCLC）的相關研究尚未見報道。本研究將進一步利用細胞和組織標本分別對OAT mRNA和OAT蛋白的表達進行檢測，以驗證前期線粒體蛋白質組學的結果并分析其臨床意義。此外，利用生物信息學方法對OAT蛋白進行初步分析和相互作用蛋白預測，為進一步探究其在NSCLC發生和發展中的作用機制奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 細胞及組織來源 人肺腺癌細胞株A549來自西安交通大學中心實驗室保存；人正常支氣管上皮細胞株16HBE購于中國醫學科學院腫瘤細胞庫；55例肺癌組織標本取自西安交通大學醫學院第二附屬醫院2006年-2011年手術病例，其中17例同時收集癌旁＞5 cm處肺組織標本，其中男性35例，女性20例，鱗癌35例，腺癌20例，27例無淋巴結轉移，28例存在淋巴結轉移，平均年齡為（58.3±10）歲。根據國際抗癌聯盟2009年第7版TNM分期標準：I期20例，II期15例，III期18例，IV期2例。所有入選病例術前未經放、化療，無肝硬化、自身免疫病等合并癥，術后經病理確診為肺癌。組織標本經福爾馬林固定，常規石蠟包埋、切片備用。

1.2 主要試劑 RPMI1640培養液、胎牛血清、青-鏈霉素溶液（美國Hyclone）；0.25%胰蛋白酶溶液（上海碧云天）；RNAfast200總RNA極速抽提試劑盒（上海飛捷）；RevertAidTMFirst Strand cDNA Synthesis Kit（美國Fermentas）；OAT及actin-beta引物（上海生工）；PCR mix（北京康為世紀）；溴化乙錠溶液、DNA Marker I、焦碳酸二乙酯（北京天根生化）；瓊脂糖粉（西班牙Biowest）；兔抗人OAT多克隆抗體（美國Abcam）；免疫組化染色試劑盒、濃縮型DAB試劑盒、中性樹膠（北京中杉金橋）；其它實驗試劑均為國產分析純。

1.3 細胞培養及RT-PCR A549和16HBE細胞用含10%FBS的RPMI 1640培養液，于37oC、5%CO2培養箱中培養2 d-3 d后用0.25%胰酶消化傳代。取對數生長期細胞，按RNAfast200試劑盒步驟進行細胞總RNA的提取。利用RNA電泳檢測其完整性，紫外分光光度法測定OD260/OD280值進行RNA定量。cDNA合成按RevertAidTMFirst Strand cDNA Synthesis Kit操作說明進行：在PCR管中加入2 μL總RNA，1 μL隨機引物，再加入RNase free H2O至總體積為12 μL，混合均勻后經65oC加熱5 min，迅速置于冰上，再依次加入5×Reaction buffer 4 μL、RNase inhibitor 1 μL、10 mM dNTP mix 2 μL、RevertAidTMM-MuLV Reverse Transcriptase 1 μL使總體積為20 μL，震蕩混勻離心后行逆轉錄反應，條件為：42oC 60 min，70oC 5 min，最后終止反應得到cDNA產物，-20oC保存備用。PCR過程：將目的基因的退火溫度從48oC-60oC之間每隔1oC設立溫度梯度進行擴增，并對模板cDNA濃度、引物量及循環數等進行適當調整，最終確立最佳PCR反應條件。

OAT的PCR擴增體系如下：1:100稀釋后cDNA 1 μL，上下游引物各1 μL，2×PCR Mix 12.5 μL，ddH2O 9.5 μL，總體積25 μL。PCR反應條件：94oC、3 min；94oC、30 s，52oC、30 s，74oC、45 s，循環35次；74oC、5 min。

Actin-beta的PCR擴增體系如下：1:1,000稀釋后cDNA 1 μL，上下游引物各1 μL，2×PCR Mix 12.5 μL，ddH2O 9.5 μL，總體積25 μL。PCR反應條件：94oC、3 min；94oC、30 s，52oC、30 s，74oC、45 s，循環35次；74oC、5 min。

PCR產物進行常規電泳并采集凝膠圖像，利用Gel-Pro專業圖像分析軟件，測定各條帶的積分光密度值（integrated optical density, IOD），以actin-beta為內參，計算A549和16HBE細胞系中OAT mRNA的相對含量。上述實驗重復3次。

1.4 組織化學染色 過程如下：脫蠟和水化、微波枸櫞酸抗原修復、3% H2O2孵育、正常山羊血清封閉、一抗（OAT 1:30稀釋）4oC過夜、二抗孵育、辣根酶標記鏈霉卵白素孵育、DAB顯色、蘇木素復染、脫水、透明并封片。用已知陽性片作為陽性對照，PBS代替一抗作為陰性對照。

免疫組織化學結果判定[3]：由兩位病理醫師采取雙盲法進行判斷，OAT蛋白以胞漿中出現棕黃色顆粒為陽性，每例隨機觀察5個高倍鏡視野。采用半定量積分法判定結果，根據陽性細胞所占百分比（＜5%：0分；5%-24%：1分；25%-50%：2分；＞50%：3分）和染色強度（未著色：0分；淡黃色：1分；中度黃色：2分；棕黃色：3分）進行評分。將兩種分值相加：0分為“-”，1分-2分為“+”，3分-4分為“++”，5分-6分為“+++”。我們將“-”定義為陰性，將“+、++、+++”定義為陽性表達。

1.5 統計學方法 所有數據應用SPSS 16.0軟件進行處理，采用χ2檢驗分析組間差異。P＜0.05為差異有統計學意義。

1.6 生物信息學分析 利用NCBI數據庫對OAT mRNA、蛋白質序列進行搜索，在此基礎上，利用ProtParam、BLAST、SOPMA、TMpred、SMART、WoLF PSORT、SWISS-MODEL Repository、NetPhos 2.0 Server[4]和ProtFun 2.2 Server[5]等在線工具和軟件對蛋白質的理化性質、蛋白同源性、二級結構、跨膜結構域、功能結構域、亞細胞定位、三維結構、磷酸化位點和功能等進行初步分析。利用IntAct、APID、MINT、DIP、STRING等蛋白質相互作用在線數據庫，分析預測可能和OAT存在相互作用的蛋白。在DAVID（The Database for Annotation,Visualization, and Integrated Discovery）平臺上對篩選出來的相互作用蛋白進行GO（Gene Ontology）功能注釋和信號通路分析。

2 結果

2.1 細胞總RNA定量及完整性鑒定 由A549所提取細胞總RNA的OD260/OD280值在1.95-2.07之間，RNA濃度平均值為255.9 ng/μL。16HBE細胞總RNA的OD260/OD280值在1.92-2.04之間，RNA濃度平均值為374.1 ng/μL，表明所提取總RNA的純度較高。1%瓊脂糖凝膠電泳清晰可見28S、18S兩條帶（圖1），無明顯雜帶或拖尾現象，且28S亮度約為18S的2倍，表明所提取總RNA的完整性較好，基本無降解。

2.2 RT-PCR結果 OAT基因在A549細胞和16HBE細胞中的PCR產物電泳結果如圖2所示，肉眼可見A549組所對應條帶與16HBE組相比較暗，經Gel-Pro軟件測定各條帶的積分光密度值（IOD），以actin-beta為內參，計算A549和16HBE細胞株中OAT基因mRNA的相對含量分別為0.20±0.05和0.57±0.07， A549組中OAT基因mRNA的相對含量較低，兩者差異約為2.85倍。

2.3 免疫組化結果 OAT蛋白以棕黃色顆粒表達于胞漿，在NSCLC組織中表達陽性率為81.82%（45/55），而在癌旁肺組織中均無陽性表達（χ2=39.080, P＜0.001），差異有統計學意義（圖3）。OAT表達為“-”、“+”、“++”和“+++”的分別有10例、27例、10例和8例（圖4）。按性別、年齡、組織病理學類型、有無淋巴結轉移、腫瘤直徑及TNM分期對NSCLC進行分組分析，結果顯示OAT蛋白在腺癌和鱗癌組間的表達差異有統計學意義（χ2=5.169, P=0.023）。OAT蛋白在肺腺癌組中的陽性率（100%）高于其在肺鱗癌組中的陽性率（71.43%）。而OAT蛋白的表達和患者性別、年齡、有無淋巴結轉移、腫瘤直徑及TNM分期無關。

2.4 生物信息學結果 OAT基因具有兩個mRNA轉錄本，分別編碼兩個不同的線粒體亞型蛋白；該基因在人類、猩猩、黑長臂猿、小鼠、大鼠、大熊貓和牛等物種間高度保守，具有較高的同源性；OAT蛋白分子量為48,534.8，理論pI為6.57，主要由亮氨酸（10.5%）、丙氨酸（8.4%）、甘氨酸（8.2%）和纈氨酸（8.0%）等組成，是一種偏向親水性的，較為穩定的蛋白質；其二級結構主要包含α-螺旋（42.14%）和無規則卷曲（29.16%）（圖5）；TMpred結構域分析軟件顯示OAT蛋白可能并不存在跨膜結構域；SMART數據庫搜索結果提示該蛋白具有結合磷酸吡哆醛和氨基轉移活性的aminotran-3結構域；OAT蛋白的亞細胞定位預測也證實了本研究前期實驗中線粒體蛋白的指向；NetPhos 2.0 Server預測磷酸化位點結果提示OAT蛋白可能存在7個絲氨酸磷酸化位點，7個蘇氨酸磷酸化位點和9個酪氨酸磷酸化位點（圖6）；圖7所示是OAT的三維結構圖，它是利用SWISS-MODEL Repository 的搜索功能，并整合SMTL、 RCSB 、PDBe 、 SCOP和CATH數據庫中的相關數據所得。初步對OAT蛋白的功能預測提示其可能在信號轉導、轉錄和轉運等方面具有一定的作用（表1）。

通過搜索IntAct、MINT、DIP、InteroPorc和STRING等在線數據庫，發現存在重復和冗余數據，為了獲得相對可靠的相互作用蛋白，進一步將具有文獻依據的相互作用蛋白總結如下（表2），表中蛋白質相互作用關系的獲取方式有：免疫共沉淀、串聯親和純化和酵母雙雜交等。

STRING數據庫的結果（圖8，圖中著色節點表示和OAT可能直接相關的分子，白色節點代表可能存在更深層次關系的分子，節點間連線以不同的顏色分別代表不同的依據來源，下方表中詳細羅列了各著色節點的相關信息及綜合評分）則進一步擴大了相互作用的預測范圍，該數據庫包含了直接（物理上）和間接（功能上）的各種相互作用關系，數據結果綜合了基因背景、高通量實驗、共表達和已知信息等，并對每一個相互作用關系進行評分，該數據庫目前涵蓋了來自1133個物種的5,214,234種蛋白質的相互作用信息。STRING數據庫預測所得與OAT相互作用蛋白中評分最高的20種蛋白依次為：OTC、ARG1、ARG2、ALDH18A1、ODC1、ALDH4A1、ASS1、ASL、ACY1、TBC1D25、TNF、TLR4、SLC22A6、SLC22A8、IL2、SLC22A7、B3GAT1、GLUD2、GLUL、SCL22A20。

表 1 OAT基因功能初步分析結果Tab 1 The functional prediction of OAT Gene

表 2 具有文獻依據的OAT相互作用蛋白及相關信息Tab 2 The binary interactions of OAT in literature

綜合各數據庫信息，篩選出54種可能和OAT存在相互作用的蛋白質并提交至DAVID在線平臺，其中52種蛋白質在DAVID中查找到對應的ID，通過Gene Ontology對這52種蛋白質進行本體論注釋，在相應參數設置條件下，發現共有35種蛋白質參與了73種不同的生物學途徑（biological process），20種蛋白質參與了14種不同的細胞組件（cellular component），27種蛋白質參與了18種不同的分子功能（molecular function）。分子信號通路分析結果（圖9）顯示有17種蛋白質參與了包括：NF-κB信號通路、NOD樣受體信號通路及精氨酸和脯氨酸代謝等在內的8個重要的信號轉導通路。

圖 1 細胞提取總RNA電泳結果Fig 1 Electrophoresis of total RNA extracted from cell lines

圖 2 OAT基因PCR電泳結果Fig 2 Electrophoresis of OAT gene PCR product

圖 3 OAT蛋白在肺鱗癌（A）、肺腺癌（B）和癌旁肺組織（C）中的表達（IHC，×400）Fig 3 The expression of OAT in squamous lung cancer (A), adenocarcinoma (B) and adjacent non-tumor lung tissue (C) ( IHC, ×400)

3 討論

OAT蛋白由位于染色體10q26的OAT基因編碼，以同源四聚體的形式存在于線粒體基質，存在兩種同工酶，分別為肝型和腎型。在OAT的催化作用下，鳥氨酸可轉化為谷氨酸，后者可進一步生成脯氨酸和谷氨酰胺，在氨基酸的生物合成和轉化過程中發揮著重要作用。該酶首先以前體的形式在細胞質中合成，轉運進入線粒體后裂解為成熟的OAT蛋白質。OAT基因遺傳缺陷可導致常染色體隱性遺傳疾病——脈絡膜視網膜環狀萎縮[6]。對于OAT和腫瘤的相關研究，前期多為檢測動物模型或細胞中該酶活性的改變。其中關于肝細胞腫瘤[7,8]、下頜下腺癌[7]、淋巴瘤[8]等的相關研究提示：隨著腫瘤的發生和發展，OAT的酶活性明顯下降。但是近年來有研究顯示在Morris肝細胞瘤中OAT的含量較正常肝臟高15倍[9]、肝癌組織中的OAT基因定量高于非肝癌組織[10]，且可能是肝臟β-catenin信號通路[11]及前列腺癌中雄激素受體[12]的靶向基因。此外，研究還發現OAT是腫瘤細胞紡錘體組裝的必需成分，通過抑制OAT，可以干擾細胞有絲分裂，誘導腫瘤細胞死亡[13]。近期，Miyasaka等[14]在采用238pu α粒子照射人支氣管上皮細胞BEP2D進行體外轉化的過程中發現，在轉化早期R15H20細胞中發現OAT蛋白高表達。Cadoret等[15]在誘導胰腺癌細胞中CapG蛋白高表達的同時也檢測到了OAT蛋白的表達上調。Jariwala等[16]在轉移性犬乳腺癌中發現OAT蛋白表達上調超過1.5倍。Wang等[17]通過蛋白質組學和RTPCR的研究結果均表明：經過己烯雌酚處理后的前列腺癌細胞中OAT表達上調，此外，還有多個凋亡和氧化應激相關的線粒體蛋白質在經歷己烯雌酚處理后也發生了表達量的變化。由此，研究者推測己烯雌酚誘導的氧化應激可能導致細胞凋亡。但對于OAT和其它相關蛋白的確切功能尚不清楚，有待進一步研究。

圖 4 OAT蛋白在肺癌組織中的表達情況示意圖Fig 4 The expression of OAT in lung cancer tissues

圖 5 SOPMA軟件對OAT二級結構預測圖Fig 5 The secondary structure prediction result of OAT by SOPMA

本實驗通過體外細胞培養，在轉錄水平對OAT基因在不同細胞間的表達差異進行比較，結果顯示肺腺癌細胞中OAT基因mRNA相對含量低。而免疫組化進行蛋白表達差異的比較，發現NSCLC中OAT蛋白表達顯著高于癌旁肺組織，這個結果和前期線粒體蛋白質組學的結果一致。對于OAT基因在轉錄和翻譯水平不一致的原因分析可能為：①在mRNA到蛋白質表達的過程中，存在轉錄后、翻譯及翻譯后各環節的精細調控，涉及mRNA的出核過程、細胞漿定位、穩定性，蛋白質翻譯和翻譯后水解、加工等，這些都可能造成轉錄物和蛋白質的豐度不一致[18,19]；②體外細胞培養和患者手術組織標本之間的差異所致；③RT-PCR和免疫組化在定量上都無法達到精確的程度，這是實驗方法本身存在的缺陷；④實驗重復次數及標本量少所造成的局限。

本研究中OAT基因在NSCLC和對照組間的表達差異是肯定的，具有統計學意義，而肺腺癌組織中OAT蛋白的表達高于肺鱗癌。雖然肺腺癌和鱗癌都起源于支氣管上皮細胞，但兩者在組織形態和生物學行為方面仍存在較大的差異。腫瘤的形成是在多種因素的影響下發生的細胞癌變，本實驗結果顯示OAT在肺腺癌中的表達高于肺鱗癌，提示OAT的表達可能與細胞病理類型的分化相關，對NSCLC的病理分型、治療方案選擇和預后判斷可能有一定的價值。此外，OAT蛋白表達與患者TNM分期、有無淋巴結轉移、腫瘤直徑等臨床病理特征無關，提示其可能是NSCLC形成過程中的早期事件。由此，我們認為OAT有望成為NSCLC的早期診斷標志物和治療的新靶點。

圖 6 OAT蛋白質的磷酸化位點預測結果Fig 6 The result of phosphorylation sites prediction of OAT

圖 7 OAT蛋白質三維結構圖Fig 7 The three-demensional structure of OAT protein

圖 8 STRING數據庫：OAT相互作用蛋白預測結果Fig 8 Predicted functional partners of OAT in STRING database

圖 9 17種蛋白質基于KEGG和BIOCARTA數據庫的信號轉導通路分析結果Fig 9 The signal pathway analysis of 17 proteins based on KEGG and BIOCARTA databases

為進一步研究OAT在NSCLC中的功能和作用機制，我們期望通過相互作用蛋白的篩選來對OAT的功能進行初步闡述。目前研究蛋白質相互作用的實驗技術方法主要有酵母雙雜交、哺乳動物細胞雙雜交、免疫共沉淀、熒光共振能量轉移、串聯親和純化、蛋白質芯片和質譜等，這些技術在蛋白質相互作用領域做出了重大的貢獻，但是實驗研究也存在一定的缺陷，通常需要特殊的實驗設備和條件，操作過程復雜，需要大量資金和人力的投入。生物信息學是在生命科學的研究中，綜合了計算機科學和應用數學的方法而形成的一門新興學科。在基因組和蛋白質組研究獲得了大量實驗數據的基礎上，生物信息學在數據的儲存、分析、檢索和共享等層面發揮了不可替代的作用。本研究通過整合多種數據庫和軟件功能，在對OAT進行初步分析的基礎上預測其相互作用蛋白并分析可能參與的生物過程和信號轉導通路。其中，TNF和TRAF6是兩種可能和OAT存在相互作用的蛋白，它們參與了NF-κB信號轉導通路，該通路是目前已知的重要的腫瘤相關信號轉導通路。此外，其他可能和OAT存在相互作用蛋白多涉及物質合成、腫瘤信號轉導及生長調控等重要生物過程。這間接提示了OAT蛋白可能通過參與多種信號轉導通路，從而在NSCLC的發生和發展中發揮重要的作用，為深入研究其在NSCLC中的作用機制提供了一個新的思路。