晚期非小細胞肺癌表皮生長因子受體基因突變情況和其對吉非替尼療效的影響

鐘巍 王孟昭 李龍蕓 夏瑩 陳閩江 張力 趙靜

晚期非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer,NSCLC）患者的治療主要以化療為主，包括一線化療和二線化療，可以延長患者的生存期和改善生活質量。近年來，表皮生長因子受體酪氨酸激酶抑制劑（epidermal growth factor receptor tyrosine kinase inhibitor, EGFR-TKI）的出現使患者生存期進一步延長，甚至部分患者可以長期生存。研究[1,2]表明EGFR-TKI的療效與EGFR基因的突變情況明顯相關，特別是外顯子19的缺失突變和外顯子21的點突變。這兩種突變占所有敏感突變的90%以上。本研究回顧性地總結了北京協和醫院2007年1月-2009年12月3年間收治的NSCLC患者EGFR基因檢測結果和基因突變對吉非替尼治療療效和不良反應的影響。

1 對象和方法

1.1 對象 均為就診于北京協醫院的患者，符合以下條件：≥18歲；均有組織學證實為非鱗癌的NSCLC；有足夠的組織標本進行EGFR基因突變檢測；臨床分期為IIIb期或IV期；患者病例資料完整。共收集患者160例，其中111例接受了吉非替尼治療。

1.2 試驗方法 收集患者的臨床資料，包括所有患者的性別、年齡、吸煙情況、組織類型和ECOG體能評分。對于接受吉非替尼治療的患者收集病例相關資料，包括：既往化療方案數，是否有骨轉移、腦轉移、肝臟轉移、其它肺葉轉移和胸腔積液，吉非替尼治療的客觀療效、疾病進展時間和死亡時間以及治療相關的不良反應（包括皮疹、腹瀉、食欲下降、肝臟轉氨酶升高和惡心/嘔吐等）。客觀療效評價根據實體瘤療效評價標準（Response Evalutation Criteria in Solid Tumor, RECIST）進行評估。無疾病進展生存期（progression free survival, PFS）定義為從開始服用吉非替尼到疾病進展或患者死亡的時間（月），生存期（overall survival, OS）定義為從開始服用吉非替尼到患者死亡的時間（月）。

1.3 EGFR基因檢測方法 所有組織標本均為患者進行治療前經病理科醫生確定為NSCLC的組織石蠟包埋切片。本研究采用限制性內切酶法聯合巢式PCR法對EGFR基因外顯子19和21進行突變檢測，該法之前已經進行了報道[3]。本研究采用的方法對之前方法稍作改進。腫瘤DNA提取采用磁珠法（北京金麥格生物技術有限公司），引物序列（表1）由上海Invitrogen公司合成。最終PCR產物由上海Invitrogen公司完成測序，使用DNAMAN軟件閱讀序列。

巢式PCR及酶切條件如下：①巢式PCR第一輪（PCR1）：反應體系：10 μL，包括DNA聚合酶及反應混合物GoTaq mix 5 μL、上下游引物（10 pm/μL）各0.5 μL、基因組DNA 5 ng-100 ng，無核酸水補齊至10 μL；反應條件：95oC 5 min；95oC 30 s，60oC 30 s，72oC 30 s，20個循環；72oC 10 min。②酶切富集突變（參見MseI或MscI說明書）：體系為20 μL，取1 μL第一輪PCR反應產物，使用MseI（對于外顯子19）或MscI（對于外顯子21）0.5 μL，10×Buffer 1 μL，無核酸水補齊至20 μL；酶切條件：37oC 4 h。③巢式PCR第二輪（PCR2）：反應體系：50 μL，包括DNA聚合酶及反應混合物GoTaq mix 25 μL、上下游引物（10 pm/μL）各3 μL、模板DNA（即PCR1產物酶切后的DNA）2 μL，核酸游離水補齊至50μL；反應條件：95oC 5 min；95oC 30 s，60oC 30 s，72oC 30 s，40個循環；72oC 10 min。

1.4 統計方法 使用SPSS 16.0軟件進行統計分析。各組患者中位OS和中位PFS的比較采用Kaplan-Meier方法計算。采用多因素Cox回歸分析各種因素對生存期的影響，包括性別、年齡、吸煙狀況、ECOG評分、病理類型、既往化療方案數、骨轉移、腦轉移、肝臟轉移、其它肺葉轉移、胸腔積液和EGFR基因突變情況。計數資料采用χ2檢驗分析包括不同亞組患者EGFR基因突變率的差異和不同亞組吉非替尼治療的客觀療效，多因素分析采用線性回歸的方法進行分析，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 一般情況 2007年1月-2009年12月共160例非鱗癌的NSCLC患者接受了EGFR基因突變的檢測，其中男性81例，女性79例；年齡＜60歲91例，≥60歲69例；吸煙58例，不吸煙102例；ECOG 0分-1分119例，≥2分41例；非腺癌17例，腺癌143例。111例接受了吉非替尼治療，其中15例為一線治療，96例為二線治療。

2.2 EGFR基因突變與臨床特征的關系 160例患者共檢測到EGFR基因突變88例（55%），其與患者臨床特征的關系見表2，可見是否有EGFR基因突變只與病理類型相關。多因素分析也顯示只有病理類型與是否有突變明顯相關（χ2=6.374, P=0.023），而其它因素無統計學意義。88例EGFR基因突變中，外顯子19缺失突變41例，外顯子21點突變47例。突變類型與患者臨床特征的關系見表3，單因素分析和多因素分析均未見任何患者臨床特征與突變類型有關。

2.3 EGFR基因突變與OS和PFS的關系 EGFR基因突變患者的OS為29.0個月（95%CI: 24.2-33.8）；而野生型患者的OS為21.0個月（95%CI: 14.7-27.3），兩者差異無統計學意義（P=0.066）（圖1）。EGFR基因突變患者的PFS為17.0個月（95%CI: 5.6-17.6）；而野生型患者的PFS為11.6個月（95%CI: 8.6-25.4），兩者有明顯差異（P=0.022）（圖2）。

表 1 突變富集PCR引物、復性溫度及產物長度Tab 1 The ME-PCR primers, annealing temperatures and the lengths of the products

表 2 EGFR基因突變與患者臨床特征的關系Tab 2 The relationship of EGFR mutation statuses and clinical characteristics

2.4 OS和PFS的影響因素分析 分析性別、年齡、吸煙狀況、ECOG評分、病理類型、既往化療方案數、骨轉移、腦轉移、肝轉移、其它肺葉轉移、胸腔積液和EGFR基因突變對總生存期的影響。多因素分析結果見表4。結果顯示只有ECOG評分、病理類型和EGFR基因突變狀態與OS相關。

分析性別、年齡、吸煙狀況、ECOG評分、病理類型、既往化療方案數、骨轉移、腦轉移、肝轉移、其它肺葉轉移、胸腔積液和EGFR基因突變對PFS的影響。多因素分析結果見表5。結果顯示ECOG評分、既往化療方案數和EGFR基因突變與PFS明顯相關。

2.5 客觀療效的影響因素分析 分析客觀療效的影響因素包括年齡、性別、吸煙情況、ECOG評分、病理類型、既往化療方案數、骨轉移、腦轉移、肝臟轉移、其它肺葉轉移、胸腔積液和EGFR基因突變狀態（表6），單因素分析顯示吉非替尼的客觀療效與性別、吸煙情況、骨轉移和EGFR基因突變狀態明顯相關。而多因素分析顯示客觀療效只與突變狀態（χ2=10.976, P=0.004）和吸煙情況（χ2=21.10,P＜0.001）相關，而其它因素無統計學意義。EGFR基因突變患者的客觀有效率為43.3%（26/60），而疾病控制率為95%（57/60），高于EGFR基因野生型的患者，分別為21.6%（11/51）和76.5%（39/51）。

表 3 各種EGFR基因突變類型的臨床特征Tab 3 The clinical characteristics of patients with EGFR exon 19 and 21 mutations

表 4 總生存期的Cox多因素分析Tab 4 Multivariate analysis of over survial

2.6 EGFR基因外顯子19突變與外顯子21突變的差別 外顯子19缺失突變患者的OS為30.0個月（95%CI: 24.2-35.8）；外顯子21點突變患者的OS為28.0個月（95%CI: 23.2-32.8），兩者無明顯差異（χ2=0.103, P=0.748）（圖3）。外顯子19缺失突變患者的PFS為17.0個月（95%CI: 5.5-28.5）；外顯子21點突變患者的PFS為16.5個月（95%CI: 3.9-29.1），兩者無明顯差異（χ2=0.060, P=0.807）（圖4）。

60例EGFR基因突變患者中外顯子19缺失突變為28例，外顯子21點突變為32例。外顯子19缺失突變患者的客觀有效率為42.8%（12/28），疾病穩定率為53.6%（15/28），疾病進展為3.6%（1/28）；而外顯子21點突變患者的客觀有效率為43.8%（14/32），疾病穩定率為50%（16/32），疾病進展為6.2%（2/32），兩組的療效無明顯差異。

圖 1 EGFR基因野生型和突變型患者的OS曲線Fig 1 The OS curves of the EGFR mutation positive and negative patients. OS: overall survival.

圖 2 EGFR基因野生型和突變型患者的PFS曲線Fig 2 The PFS curves of the EGFR mutation positive and negative patients. PFS: progression free survival.

圖 3 EGFR基因外顯子19缺失突變和21點突變患者的OS曲線Fig 3 The OS curves of the patients with EGFR exon 19 and 21 mutations

圖 4 EGFR基因外顯子19缺失突變和21點突變患者的PFS曲線Fig 4 The PFS curves of the patients with EGFR exon 19 and 21 mutations

表 5 PFS的Cox多因素分析Tab 5 Multivariate analysis of progression free survival

2.7 不良反應 患者使用吉非替尼的不良反應較少，主要為皮疹和腹瀉，發生率分別為48.6%（54/111）和18.9%（21/111），但多數為輕度不良反應，不需要處理和停止吉非替尼治療（表7）。EGFR基因野生型和突變型患者的不良反應無明顯差別。

3 討論

EGFR-TKI是近年來NSCLC治療中最重要的進展，特別是發現EGFR基因突變與EGFR-TKI的療效明顯相關[1,2]。普遍認為非鱗癌患者EGFR突變率較高，所有的非鱗癌患者都建議接受EGFR基因突變檢測。本研究檢測了160例非鱗癌的NSCLC，結果發現突變率達到55%，與相關文章報道相似[4]。IPASS試驗[5]中進行EGFR基因突變檢測的患者中突變陽性率為60%（261/437），該試驗入組的患者都是腺癌和不吸煙或輕微吸煙的患者，而且EGFR基因突變中外顯子19和外顯子21突變所占的比例為90%以上。本研究發現在臨床指標中，僅有病理類型和突變相關，腺癌的突變率高于大細胞肺癌和不能分型的NSCLC。

吉非替尼是最早研發的EGFR-TKI，本研究顯示EGFR基因突變患者的PFS明顯優于EGFR基因野生型患者，與文獻報道一致。在IPASS試驗[5]中發現EGFR基因突變陽性的患者的PFS為9.5個月，而野生型患者僅為1.5個月。這個差別遠大于本研究，可能與IPASS試驗是一線治療試驗，即患者之前未接受過化療，而本研究的患者大部分都是化療后才接受了吉非替尼的治療有關。多數文章[5-12]均報道EGFR基因突變不僅是EGFR-TKI的療效預測因素，也是患者生存的預后因素。在吉非替尼的一線治療IPASS試驗[5]中，EGFR基因突變患者的總生存期為21.6個月，而野生型為11.2個月；二線治療INTEREST試驗[6]中分別為14.2個月和6.4個月。本研究中兩組的總生存期分別為29.0個月和21.0個月，雖然兩組總生存期有8個月的差異，但未達到統計學差異。其原因可能為兩組的總生存期都很長并且兩組患者例數偏少。

多因素分析顯示OS的影響因素為ECOG評分和病理類型，PFS的影響因素為ECOG評分、既往化療方案數和EGFR基因突變。提示了雖然吉非替尼可以用于ECOG評分3分-4分的患者和三線甚至更晚使用仍然有效，但是除了EGFR基因突變外，ECOG評分越差和既往的化療方案越多，則吉非替尼治療的PFS越差，患者的獲益越小。特別是ECOG評分與患者生存也相關，提示要在患者一般情況好時就使用吉非替尼，而不是等到患者情況惡化時。

表 6 患者臨床特征對客觀療效的影響Tab 6 The influence of clinical characteristics on objective effects

表 7 不良反應發生率Tab 7 Rate of adverse events

本研究中EGFR基因突變患者的客觀有效率為43.3%，高于EGFR基因野生型的患者（21.6%）。多篇文獻報道對于最初EGFR基因突變陽性的人群，EGFR-TKIs作為二/三線治療和一線治療的客觀有效率是有差異的，分別為30%-40%[6-10]和70%[5,11,12]，這與本研究中EGFR基因突變患者的客觀有效率為43.3%是一致的?；熀驟GFR基因突變患者EGFR-TKI療效下降的原因不清楚。韓如冰等[3]報道化療前后外周血EGFR基因突變狀態一致率僅為54.5%（18/33），部分患者化療前EGFR基因突變陰性變為陽性，部分患者化療前陽性變為陰性。Chin等[13]將含有EGFR外顯子19缺失突變的NSCLC細胞系PC9細胞系經過鉑類化療藥物處理耐藥后，再使用厄洛替尼，發現厄洛替尼的敏感性降低，說明化療可能在酪氨酸激酶激活通路上亦有作用。因此二/三線EGFR-TKIs治療有效率的降低可能部分歸因于由于化療導致的EGFR-TKIs耐藥，具體機制有待進一步臨床研究證實。

近90%的EGFR基因突變集中于外顯子19的缺失突變和外顯子21點突變，本研究顯示兩種突變的PFS和OS均無差別。在IPASS試驗[5]中，接受吉非替尼的EGFR基因外顯子19缺失突變患者和外顯子21點突變患者分別為66例和64例，兩種突變患者的PFS均大約為9個月。NEJ002試驗[11]中，接受吉非替尼的EGFR基因外顯子19缺失突變患者和21外顯子點突變患者分別為58例和49例，兩種突變患者的PFS分別為11.5個月和10.8個月。上述兩試驗與本研究相似，提示突變類型與治療效果無明顯關系。EGFR基因外顯子19缺失突變和外顯子21點突變的客觀有效率也無明顯差別。

由于本研究是一項回顧性研究，結果也可能存在著一些偏倚。綜上所述，晚期非鱗癌NSCLC EGFR基因突變患者的PFS明顯優于野生型患者，OS有延長趨勢。EGFR基因不同突變類型的PFS和OS均無差別。