肥大細胞和蛋白酶激活受體-2表達在胃食管反流病中的意義

高 欣 張振玉 徐兆軍 姜宗丹 陳菲菲 王勁松

南京醫科大學附屬南京醫院消化科1(210006) 病理科2

胃食管反流病(GERD)系指胃內容物反流入食管，引起不適癥狀和(或)并發癥的一種疾病，可分為非糜爛性反流病(NERD)、糜爛性食管炎(EE)和Barrett食管(BE)［1］。肥大細胞(mast cells，MC)是一種廣泛存在于人體組織，尤其是皮膚、呼吸道和消化道的組織細胞，胞質內有大量含組胺、類胰蛋白酶(tryptase)、肝素等介質的分泌顆粒，MC活化脫顆?？稍诮M織內引起速發型過敏反應(炎癥)。多項研究［2～6］發現MC活化脫顆?；蚣毎芙忉尫诺难装Y介質參與了酸或膽汁誘導的食管黏膜損傷。蛋白酶激活受體－2(protease－activated receptor－2，PAR－2)廣泛表達于消化道，可被胰蛋白酶激活，誘導促炎反應。對不同類型GERD患者和無反流對照者食管黏膜中 PAR－2 表達和分布的研究［7，8］顯示，PAR－2活化和表達上調在GERD的發生及其相關黏膜改變和炎癥反應中起重要作用。本研究采用免疫組化方法檢測GERD患者食管黏膜上皮中的MC數量和PAR－2表達情況并分析其間的相關性，旨在明確兩者在GERD發病中的意義。

對象與方法

一、研究對象

納入62例于2007年1月～2008年12月因反酸、燒心等反流癥狀在南京醫科大學附屬南京醫院就診，經胃鏡檢查、24 h食管pH監測和質子泵抑制劑(PPI)試驗確診的 GERD 患者。診斷標準［1，9］:①24 h食管pH監測DeMeester評分＜14.72為酸反流陰性，≥14.72為酸反流陽性(病理性酸反流);②內鏡檢查見食管遠端黏膜破損，排除其他原因后可診斷為EE;③有典型或不典型反流癥狀，內鏡檢查未見食管黏膜破損且24 h食管pH監測或PPI試驗結果陽性可診斷為NERD。同期20例無反流癥狀、胃鏡檢查無異常發現、對研究方案知情同意的非GERD患者作為正常對照組。研究方案經醫院倫理委員會審核、批準。

二、研究方法

1.標本采集:入組受檢者于胃鏡檢查時在齒狀線上方2～3 cm鱗狀上皮處(EE患者于糜爛周圍相對正常黏膜處)取一塊活檢組織，4%甲醛溶液固定24 h，常規脫水、透明、石蠟包埋、切片，用于免疫組化染色。

2.免疫組化染色:采用EnVision免疫組化二步法(EnVision免疫組化檢測試劑盒，DAKO公司)。鼠抗人MC類胰蛋白酶單克隆抗體為福州邁新生物技術開發有限公司產品，可直接使用，無需稀釋;山羊抗PAR－2多克隆抗體為Santa Cruz Biotechnology，Inc.產品，使用時按1∶200稀釋。具體操作步驟參照試劑盒說明書。

3.MC計數:類胰蛋白酶陽性MC呈棕褐色。于光學顯微鏡下(×400)選取陽性細胞密度最高的5個視野進行計數，取均值。

4.PAR－2免疫組化評分:PAR－2陽性細胞胞質呈棕色。于光學顯微鏡下(×100)選取表達強度最高的5個視野，分別行胞質著色評分和陽性細胞比例評分，PAR－2免疫組化評分為各視野兩項評分乘積的均值。胞質著色評分:無表達，0分;弱表達，1分;中等表達，2分;強表達，3分。陽性細胞比例評分:無陽性細胞，0分;＜10%，1分;≥10%且＜50%，2分;≥50%且＜80%，3分;≥80%，4分。

三、統計學分析

應用SPSS 17.0統計軟件，計數資料以率或構成比表示，組間比較采用χ2檢驗，計量資料以表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD法，兩變量間相關性的分析采用Pearson相關分析，P＜0.05為差異有統計學意義。

結 果

一、一般情況

62例 GERD患者中男34例，女28例，年齡26～78歲，平均(50.0±13.7)歲。EE組30例，男18例，女12例，年齡29～74歲，平均(49.4±11.5)歲;NERD組32例，男、女各16例，年齡26～78歲，平均(51.1±15.2)歲。20例正常對照者中男、女各10例，年齡27～75歲，平均(63.8±7.1)歲。三組間性別構成和平均年齡差異無統計學意義。

二、食管黏膜上皮MC數量

食管黏膜上皮類胰蛋白酶免疫反應產物主要定位于MC胞質中，少數MC胞質、胞核均著色。EE組和NERD組MC數量均明顯多于正常對照組，組間差異有統計學意義，EE組與NERD組間差異無統計學意義(見圖1、表1)。

三、食管黏膜上皮PAR－2表達

食管黏膜上皮PAR－2免疫反應產物定位于細胞質。EE組和NERD組PAR－2免疫組化評分均明顯高于正常對照組，組間差異有統計學意義，EE組與NERD組間差異無統計學意義(見圖1、表1)。

圖1 MC、PAR-2在各組食管黏膜上皮中的表達和分布(免疫組化染色，×100)

表1 各組食管黏膜上皮MC數量和PAR-2免疫組化評分比較()

表1 各組食管黏膜上皮MC數量和PAR-2免疫組化評分比較()

＊與正常對照組比較，P＜0.01

組 別 例數 MC數量 PAR－2免疫組化評分正常對照組20 2.82±1.01 2.56±1.20 NERD組 32 7.23±1.55* 6.09±1.55*EE組 30 7.36±0.97* 6.15±1.44*

四、GERD患者食管黏膜上皮MC數量與PAR－2免疫組化評分的相關性

Pearson相關分析顯示，EE組和NERD組中的MC數量均與PAR－2免疫組化評分呈正相關(r=0.875，P ＜0.01;r=0.884，P＜0.01)。

討 論

MC是一種重要的炎性細胞，廣泛分布于消化道黏膜，組織發生炎癥反應時，MC可被激活，進而產生脫顆粒效應，釋放大量炎癥介質，放大炎癥反應。Barclay等［6］予負鼠食管腔內灌注 HCl，發現其食管黏膜著色MC數量較對照組減少約50%，MC平均面積、核面積和完整顆粒面積亦顯著降低，提示食管酸暴露可使黏膜中的MC活化脫顆?；蚴辜毎芙忉尫叛装Y介質，從而參與EE的病理生理學機制。其后多項研究［2～5］證實食管黏膜暴露于酸或膽汁可激活MC脫顆粒釋放炎癥介質，進而引起食管黏膜損傷。類胰蛋白酶是活化的MC釋放的介質之一，具有胰蛋白酶樣活性，在MC介導的多種反應中起重要作用，常被作為MC活化的標記物［10］。本研究以類胰蛋白酶陽性細胞代表MC，發現EE組和NERD組食管黏膜上皮中的MC數量顯著多于正常對照組，證實了MC在GERD發病機制中的作用。

PARs家族迄今已發現四種亞型，分別為PAR－1、PAR－2、PAR－3、PAR－4，其中 PAR－2 廣泛表達于內皮組織、粒細胞以及消化道，能被多種絲氨酸蛋白酶，如胰蛋白酶、類胰蛋白酶激活，在胃腸道炎癥反應中起重要作用。Kandulski等［7］發現GERD患者食管黏膜上皮中的PAR－2基因表達顯著上調，上皮層PAR－2彌漫強陽性染色，PAR－2表達上調與促炎細胞因子白細胞介素－8(IL－8)表達以及食管黏膜組織形態學改變呈正相關;體外實驗亦顯示，培養于酸性培養基中的食管鱗狀上皮細胞PAR－2基因表達顯著上調，PAR－2的活化可引起 IL－8表達和分泌。這些發現提示PAR－2介導的通路參與了GERD的發病機制。Inci等［8］的研究顯示食管黏膜上皮中的PAR－2可被十二指腸胃食管反流物中的胰蛋白酶激活，胰蛋白酶－PAR－2通路參與了GERD的發病機制。本研究同樣觀察到EE組和NERD組食管黏膜上皮中的PAR－2表達顯著強于正常對照組，證實PAR－2表達上調與GERD的發生密切相關。

何韶衡等［11，12］發現 PAR－2 激動劑可高效激活人結腸MC，誘導其釋放類胰蛋白酶和組胺，表明MC上可能存在PAR－2，PAR－2為MC表面的重要受體。推測MC可通過其分泌的類胰蛋白酶激活自身或鄰近MC的PAR－2，對脫顆粒信號進行自我放大，從而放大炎癥反應。Jacob等［13］的研究證實，在應激和炎癥狀態下，MC釋放的類胰蛋白酶可激活結腸細胞上的PAR－2，從而增加細胞間隙通透性。目前尚未見關于MC與PAR－2在GERD中關系的報道。本研究發現EE和NERD患者食管黏膜上皮中的MC數量增多、PAR－2表達上調且兩者呈正相關，提示MC在GERD患者食管黏膜損傷中的作用可能與PAR－2的活化有關，且兩者在EE和NERD中的作用未顯示出明顯差異。

綜合本研究以及既往研究結果，可以認為食管黏膜上皮中的MC與PAR－2共同參與了GERD的發病機制。推測在GERD發生過程中，食管黏膜上皮中的PAR－2被廣泛激活，分布于MC表面的PAR－2活化后激活MC，誘導其脫顆粒釋放炎癥介質，同時反流的酸或膽汁亦可能激活MC，而MC釋放的類胰蛋白酶又可激活PAR－2，MC由此對脫顆粒信號進行自我放大，從而放大炎癥反應，加重食管黏膜損傷。由于本研究采用的是回顧性研究方法，對入組GERD患者的病史資料掌握有限，缺乏EE內鏡分級資料，且內鏡活檢組織均取自肉眼觀察相對正常的食管黏膜，常規病理檢查無特殊發現，故未能進一步分析MC和PAR－2與EE內鏡分級、食管黏膜組織病理學表現之間的關系以及患者接受規范治療前后兩者的變化。后續研究擬采用前瞻性研究方法，對MC和PAR－2在GERD發病機制中的作用進行更深入的探索。

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